製藥工藝學實驗
學習指導書
（第六版）
西南科技大學
生命科學與工程學院
二○一二年二月
實驗一離子交換層析分離混合氨基酸
一.目的要求
學習採用離子交換樹脂分離混合氨基酸的基本原理並掌握離子交換層析法的基本操作技術。
二.實驗原理
離子交換層析法主要是根據物質解離性質的差異進行分離的方法。本實驗用苯乙烯性季銨型陰離子交換樹脂分離酸性氨基酸（天冬氨酸pi=2.77）以及鹼性氨基酸（賴氨酸 pi=9.
74）的混合液。在特定的 ph 條件下，它們與樹脂的結合能力和解離程度不同，通過改變洗脫液的ph值或鹽離子濃度可進行分離。
三.實驗器材和試劑
1.苯乙烯性季銨型陰離子交換樹脂（201×7，717型，100-200目）
2.1mol/l hcl、1mol/l na0h
3.標準氨基酸溶液：天冬氨酸、賴氨酸各稱量100mg，混合加入ddh2o 20ml，置棕色滴瓶避光儲存。
4.洗脫液（ph 4.2的檸檬酸緩衝液）：檸檬酸54m1加0.1mol／l檸檬酸鈉46ml
5.氨基酸顯色液（茚三酮溶液）：2g茚三酮溶於100ml無水乙醇中。
6.砂芯層析柱（ф1×20cm）、試管（ф1×12cm）及試管架（40孔）、鐵架臺（帶夾）、膠頭長滴管、牛角藥匙、橡皮筋（捆試管）、250ml抽濾瓶（帶砂芯漏斗）、稱量紙、ph試紙（1-14）（0.5-5）
7.電子天平（千分之一）、恆溫水浴鍋、真空幫浦
四.實驗方法
1.樹脂的處理：100ml燒杯中置約10g樹脂，加25ml 1mol/l hcl攪拌2h，傾棄酸液，用ddh2o充分洗滌樹脂至中性。
加25ml 1mol/l naoh 至上述樹脂中攪拌2h，傾棄鹼液，用ddh2o充分洗滌至中性。再用1mol/l鹽酸浸泡2h，轉型為cl-型，最後再用ddh2o充分洗滌至中性備用。（教師準備）
2.裝柱：取潔淨乾燥ф1×20cm砂芯層析柱1支，用夾垂直固定於鐵架台上，關閉下端出口，自頂部沿管壁緩慢加入ddh2o，待液面高於砂芯2cm處停止。
然後自頂部緩慢沿壁用玻棒引流注入經處理的樹脂的懸浮液（幹樹脂加少量ddh2o攪拌使樹脂懸浮），待樹脂沉降後，開啟下端出口旋鈕逐步放出過量的ddh2o（注意控制流速，保證液面高度不低於樹脂層），再補加入一些樹脂，直至樹脂沉積至12cm高度即可。保持柱床表面水平（不水平，可以用玻棒適當攪拌調整）。當液面高出樹脂表面1cm左右時，關閉柱子出口。
3.加樣、平衡：開啟層析柱下端出口使ddh2o緩慢流出，待液面下彎月面幾乎平齊樹脂表面時關閉出口（不可使樹脂表面乾燥，否則加液時會混入氣泡）。
用膠頭長滴管將5滴氨基酸混合液輕輕地滴加到樹脂頂部，開啟出口使其緩慢流入柱內（1滴/3s）。當液面下彎月面剛平樹脂表面時，關閉出口。這時以同樣方式在柱頂緩慢注入ddh2o 少許，並開啟下端出口，開始平衡，出口溶液立即開始用試管收集，保持流速20滴／min（盡量準確），每管20滴，逐管收存，在收集同時注意用膠頭長滴管補充柱床頂部ddh2o（加入時輕緩，勿擾亂柱床頂部也勿使樹脂表面乾燥）。
在收集洗脫液的過程中，每5管需檢驗氨基酸的洗脫情況，方法如下：於各管洗脫液中加20滴（約1ml）氨基酸顯色液，沸水浴中加熱10min，如溶液顯紫藍色，表示已有氨基酸穿透下來。顯色的深度可代表濃度，可進行比色測定。
4.洗脫：在檢測到第乙個氨基酸穿透流出後，再收集兩管茚三酮反應陰性部分，關閉層析柱出口，將樹脂頂部的剩餘ddh2o移去。
這時在樹脂頂部加入少許洗脫液，開啟出口使其緩慢流入柱內，按上述操作方式用洗脫液洗脫並立即開始逐管收集（1滴／3s），每管20滴。同樣每收集5管做次氨基酸檢測，在第二個氨基酸完全洗脫下來以後，再繼續收集兩管茚三酮反應陰性部分。最後以洗脫液各管的顏色深淺（以加樣洗脫液為空白，其餘根據顏色狀況以表示）為縱座標，洗脫液管號為橫座標作圖，畫出洗脫曲線。
5.樹脂再生：實驗結束後從柱中將樹脂取出（用少量ddh2o和玻棒攪拌倒出），用2mol/l hcl浸泡2h，再用ddh2o洗至中性備用。
若需長時間儲存，請砂芯過濾後置於20%乙醇中避光儲存。
四.注意事項
1.裝柱時須防止氣泡混入樹脂層、分層及液面在樹脂表面以下等現象發生。
2.使用砂芯層析柱時，輕拿輕放，並注意保護好其它玻璃器皿。
3.水浴時因茚三酮乙醇溶液揮發易引起手部**染色，請盡量用試管夾或毛巾取放試管。
5.實驗結果及思考題
繪製洗脫曲線並完成以下思考題
1.離子交換樹脂應如何儲存？ 3.如果混合氨基酸中包含中性氨基酸丙氨酸，實驗應如何設計？
附錄1：717型樹脂特點
別名：強鹼性i型陰離子交換樹脂
cas號：122560-63-8
儲存條件：常溫
含水量：40.0～50.0% 交換容量：≥3.0mmol/g 粒度（0.3～1.2mm）:≥95.0% 型號：cl-（氯型）
性狀：淡黃色透明球狀顆粒。是在苯乙烯-二乙烯苯共聚基體上帶有季銨基〔-n（ch2）3oh〕的陰離子交換樹脂，該樹脂具有機械強度好，耐熱性能高的特點。
本產品相當於美國amberlite ira-400，西德lewatit m500日本diaion sa-10a
用途：科研、實驗
附錄2：茚三酮反應
茚三酮反應：在弱酸條件下（ph5-7），蛋白質或氨基酸與茚三酮共熱，可生成藍紫色縮合物，只有脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應產生黃色物質。
附錄3：20種氨基酸的性質
實驗二凝膠層析分離核黃素、藍色葡聚醣和細胞色素c
一.目的要求
學習並掌握凝膠層析技術的工作原理和基本操作技術。
二.實驗原理
凝膠過濾技術廣泛應用於蛋白質、酶、核酸等生物高分子分離分析。它是以被分離物質的分子量差異為基礎的一種層析方法。此類層析的固相載體是具有分子篩性質的凝膠，目前使用較多的是具有各種孔徑範圍的葡聚醣凝膠（商品名為sephadex）、聚丙烯醯胺凝膠（商品名為biogel）以及瓊脂糖凝膠（商品名為sepharose），此外還有這些凝膠的各類衍生物。
葡聚醣凝膠是由一定分子量的葡聚醣（右旋糖苷）和甘油基以醚橋（-0-ch2-ch-ch2-o-）形式相互交聯形成三維網狀結構的一種水不溶性物質。通過控制交聯劑環氧氯丙烷和 0h 單體葡聚醣的配比以及交聯時的反應條件控制交聯度而獲得具有不同「網眼」的凝膠。「網眼」大小決定了被分離物質能夠自由出入凝膠內部的分子量範圍，可分離的分子量從幾百到數十萬道爾頓不等。
由於凝膠骨架中的多醣鏈含有大量oh基，因此凝膠具有極強的親水性，能在水和電解質溶液中膨脹。不同型號的交聯葡聚醣用g表示（如g-25，g-100等），g後面的數字為凝膠的吸水量（ml水/g乾膠）乘以l0得到的數值，如g-100即表示此型號凝膠吸水量是10ml／g乾膠。
進行工作時一般根據欲分離物質的大小及工作目的來選擇合適的葡聚醣凝膠裝層析柱。待分離的物質通過此柱時，各組分相互之間由於分子量大小各不相同以及在固定相上的阻滯作用的差異而在柱中以不同的速率移動。分子量大於允許進入凝膠「網眼」範圍的物質完全被凝膠排阻，不能進入凝膠顆粒內部，阻滯作用小，隨著溶劑在凝膠顆粒之間流動，因此流程短，移動速度快而先流出層析柱；分子量小的物質可完全滲入凝膠顆粒，阻滯作用大，流程長，移動速度慢，從層析柱中流出就較晚。
若物質分子量介於完全排阻和完全滲入的凝膠物質的分子量之間，則在二者之間從柱中流出。由此就可達到分離的目的。
對於混合物中某一被分離成分在凝膠層析柱內的洗脫行為，常用分配係數kd來度量。
kd =
式中 v0--外水體積，即凝膠柱中凝膠顆粒之間所含水或緩衝液體積
vi—內水體積，即凝膠顆粒內部所含水相的體積；
ve—洗脫體積，即被分離成分通過凝膠柱所需洗脫液的體積。
當一種被分離成分的分子全排阻時，其洗脫體積就是v0，而如果其分子直徑小於凝膠孔徑下限時，其洗脫體積為v0+vi.在一般情況下，kd值分布在0和1之間，即0≤kd≤1，而洗脫峰都出現在v0≤ve≤v0＋vi之間。
本實驗採用葡聚醣凝膠g-100作為固相載體，它適用於分子量範圍在4000～150000之間的多肽與蛋白質的分離。當核黃素（分子量376）、細胞色素c（分子量12000）和藍色葡聚醣（分子量200000）混合物流經層析柱時，藍色葡聚醣分子量最大，最先流出；細胞色素c第二個流出；核黃素由於完全滲入凝膠顆粒內部而最後流出。通過洗脫曲線可以清楚地觀察出葡聚醣凝膠g-100對三種物質的分離效果。
鑑於凝膠是一種不帶電荷的惰性物質，本身不會與被分離物質相互作用，因而分離效果好，重複性高。凝膠過濾所需儀器裝置簡單，操作簡便，每次樣品洗脫完畢則已經再生，可反覆使用。這些優點使凝膠過濾法成為一種應用廣泛的分離分析方法。
三.實驗材料
（一）試劑
g-100
2.細胞色素c
3.藍色葡聚醣2000
4.核黃素
5.洗脫液：0.05mol/l 的nacl溶液
6.無水乙醇
（二）器材
1.玻璃層析柱：ф2.6×20cm 1支。
2.50ml、100ml燒懷各1只。
3.膠頭長滴管1支，玻璃棒l支。
4.1.0×12cm小試管30支。
5.40孔塑料試管架1個。
6.鐵架臺（帶夾子）
7.抽濾瓶、砂芯漏斗各1個
四.實驗方法
1.樣品準備：取藍色葡聚醣0.01g，0.02g核黃素和0.1g細胞色素c，用20ml蒸餾水溶解，濾紙過濾備用（可根據實驗顏色深淺調整）。
2.凝膠的準備與裝柱：稱取10g sephadex g-100，加蒸餾水300ml，室溫溶脹4h。
用傾瀉法除去凝膠上層水及細小顆粒，反覆以蒸餾水洗滌直至液面無細小顆粒為止，然後放在抽濾瓶內，水幫浦抽氣脫氣，最後儲存於蒸餾水內備用。
取ф2.6×20cm潔淨乾燥的砂芯層析柱，關閉出口，加入5m1蒸餾水，使液面高於砂芯2cm，然後將溶脹後的凝膠攪勻並沿壁玻棒引流加入柱中，待柱底凝膠沉積高度1cm時，開啟柱的開口，繼續裝柱至柱床高度為4cm，關閉出口。裝柱過程嚴禁產生氣泡及柱床分層，如有氣泡及分層應重灌。
裝完後，用細玻捧輕輕攪動柱表面，待凝膠自然沉降形成平面後。再用20ml（1bv）洗脫液按流速2ml/min洗滌至柱床表面不再下降，使柱床穩定。
3.樣品分離：開啟層析柱出口，使柱面溶液緩慢流出，直至床面與液面剛好齊平為止（注意，不可使床面液體流乾!
）。關閉出口，將20滴樣品混合液（1ml=1/20bv）直接滴加於柱面中心，勿使床面擾動，開啟出口，讓樣品液進入柱子（下端流速3滴/s），待樣品液進入凝膠填料後，開始用洗脫液洗脫並同時開始收集（柱頂用膠頭滴管不斷補充洗脫液，操作輕微，勿擾動柱床），控制流速大約20滴／min，每管收集20滴，至黃色核黃素完全洗脫出來後停止收集，觀察洗脫液顏色，最後以洗脫液各管的顏色和顏色深淺（以表示）為縱座標，流出液體積為橫座標作圖，即可畫出一條洗脫曲線。
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