寧波大學2023年srip專案
結題報告
專案名稱：牛皮膠原蛋白的提取工藝研究
專案負責人： 王亞軍
所在學院：生命科學與生物工程學院
聯絡**： 150********（564433）
研究起止時間： 2010-03 至 2011-04
填報時間： 2011 年 06 月 26 日
寧波大學學生科研管理工作小組製表
填表說明
1. 本報告是專案實施完成後的全面回顧與總結，是評價研究工作和今後評審新專案的重要依據。專案負責人須認真填寫，填寫內容必須真實、準確、齊全。
2. 本報告要求一式乙份，並附科研成果一同上交校學生科技創新協會辦公室。
附件1------研究報告：
牛皮膠原蛋白的提取工藝及研究
摘要：為在生產過程中提高牛皮利用率，**了牛皮膠原蛋白提取的最佳工藝。採用酸—酶結合的方法對牛皮中膠原蛋白進行提取得出最佳工藝，正交實驗得出最佳提取工藝為：
乳酸—胃蛋白酶法，料液比1：25、加酶量6000u/g、ph值2.0、溫度35℃、酶解時間11h。
結果表明，採用此法提取牛皮中膠原蛋白提取率達到80%以上，具有一定應用價值。
關鍵詞：牛皮，膠原蛋白，酸-酶結合，酶解
0 前言
我國是世界肉類生產和消費大國，牛肉在肉類消費中佔了很大的比重，而牛皮等副產品卻主要用在皮革產業致使其利用率不高。牛皮中含有豐富的膠原蛋白，膠原蛋白無論在食品領域，還是在醫學以及化妝品領域都有很高的應用價值，因此對牛皮中膠原蛋白的提取將有較高的經濟效益及實用價值。當前關於膠原蛋白的國內外研究主要集中在其提取工藝以及應用研究上，而提取工藝的研究則主要還是傳統的酸法、鹼法、酶法，這幾種提取方法都有不同形式的劣勢使提取效果不太理想。
本文採用酸-酶結合的方法對牛皮中膠原蛋白進行提取，得出最提取佳工藝，實驗表明，採用此種方法牛皮膠原蛋白的提取率將達到到80%以上，具有良好效果。
1 材料與方法
1.1 實驗主要原料及試劑
新鮮牛皮由寧波萊盛農業科技實業****提供
l-羥脯氨酸生化級上海潤成生物科技****
高氯酸分析純國藥製劑
檸檬酸分析純國藥製劑
冰醋酸分析純天津市永大化學試劑開發中心
氫氧化鈉分析純國藥製劑
氯胺t分析純國藥製劑
無水碳酸鈉分析純國藥製劑
胃蛋白酶生化試劑amresco
木瓜蛋白酶生化試劑廣西南寧龐博生物工程****
對二甲氨基苯甲醛分析純國藥製劑
其他試劑為實驗室常規試劑
1.2 主要儀器及裝置
hws26型電熱恆溫水浴鍋上海一恆科技****
bp-211d電子天平德國sartorius公司
pb-10ph計德國sartorius公司
dhg-9140a型電熱鼓風乾燥箱寧波江南儀器廠
kdn-04消化爐上海新嘉電子****
t6-新銳可見分光光度計北京普析通用****
fd-id80真空冷凍乾燥機
tgl-16g台式高速冷凍離心機
hkcb-3型恒控磁力攪拌器
其它為實驗室常用裝置
1.3 實驗方法
1.3.1 牛皮基本成分測定
水分含量測定：直接乾燥法（gb/t 5009.3-2003)
灰份含量的測定：灼燒重量法（gb 5009.4-85)
蛋白質含量的測定：凱氏定氮法 （gb/t 5009.5-2003)
總脂肪含量的測定：索氏提取法（gb/t 14772-2008)
1.3.2 羥脯氨酸標準曲線的繪製
按照gb/t 9695.23-2008《肉與肉製品羥脯氨酸含量的測定》方法，繪製標準曲線，建立線性回歸方程；空白對照用蒸餾水代替，過程同前。
1.3.3 牛皮中膠原蛋白總量的測定
準確稱取4.00g牛皮於錐形瓶中，加入30ml 3mol/l硫酸，用表面皿蓋住，置於105℃乾燥箱內水解16h。水解結束後趁熱過濾，將濾液稀釋至250ml容量瓶，再用蒸餾水定容至刻度。
再取2.5ml稀釋液稀釋至250ml容量瓶定容，測定牛皮中羥脯氨酸總量，按照gb/t 9656.23—2008/iso 3496:
1994測定稀釋後樣品溶液中羥脯氨酸的濃度，樣品中提取出來的羥脯氨酸含量計算按照公式計算：
x=6.25c/(m×v公式1）
其中式中：
x：式樣中羥脯氨酸含量，%
c：由標準曲線得到的式樣溶液中羥脯氨酸的濃度，μg/ml
m：試樣質量，g
v：從250ml容量瓶中吸取濾液的體積，ml
1.3.4 牛皮膠原蛋白提取工藝**
工藝流程如下：
牛皮→原料整理、除脂、除雜蛋白→酸、酶結合法提取→鹽析→透析→冷凍乾燥→膠原蛋白
1.3.4.1 牛皮的處理：
切塊：將新鮮牛皮切成0.5~1cm的小塊，用清水清潔；
脫脂：配置5~10%的na2co3溶液作為脫脂劑，加入4~5倍40℃溫水，再加入一半的脫脂液，磁力攪拌十分鐘，濾去溫水，再重複上述方法一次，最後用清水漂洗兩次；
鹽提： 用10%nacl浸泡過夜除去可溶性雜質，用清水漂洗2~3次，除去鹽分；
1.3.4.2 胃蛋白酶活力的測定
由於酸性條件下酶解，所以本實驗直接採用酸性蛋白酶-胃蛋白酶，按照sb/t 10317-1999測定，首先繪製標準曲線。實驗過程中乾酪素不能很好的溶解，經過資料查詢，將乾酪素先溶於濃乳酸，再加緩衝溶液，然後通過naoh調節ph值到2.5，即可配置成酪蛋白溶液，然後再根據測定即可。
資料分析：
實驗定義在40℃下每分鐘水解酪蛋白產生1μg酪氨酸為1個蛋白酶活力單位（u）
樣品中蛋白酶活力單位（乾基公式2）
其中式中：
a：有樣品測定的od值，查標準曲線得相當的酪氨酸微克數
4：4ml反應液取出1ml測定
n：酶液稀釋倍數
10：反應10分鐘
w：樣品水分百分含量
1.3.4.3 酸介質的選擇
**不同的酸介質對於膠原蛋白提取率的影響，取牛皮4g，設定三個實驗組酸介質分別為乳酸、醋酸、檸檬酸，均在5000u/g加酶量、ph值2.6、溫度35℃、料液比1：10、時間5h條件下酶解。
酶解之後，將酶解液4000r/min離心20min，取上清液5ml於錐形瓶中，加入5ml 3mol/l硫酸，於105℃烘箱中水解16h，取水解液1ml，稀釋至100ml，測定稀釋液中羥脯氨酸濃度同前。
稀釋樣品中羥脯氨酸含量的計算如下公式：
x=（f×c×v×10-6×100）/m公式3）
其中式中：
x：式樣中羥脯氨酸含量，%
c：由標準曲線得到的式樣溶液中羥脯氨酸的濃度，μg/ml
m：試樣質量，g
v：加入酸介質的總體積，ml
提取率的計算：
提取率（%）=水解後樣品中羥脯氨酸含量/牛皮中羥脯氨酸含量公式4）
1.3.4.4 單因素實驗
選擇最佳酸提介質乳酸，根據資料查詢在適宜範圍內選擇變數進行單因素試驗。
1.3.4.4.1 加酶量的選擇
探索加酶量對於牛皮膠原蛋白提取率的影響。進行六組實驗，每組取牛皮4g，按照加酶量分別為1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000u/g牛皮來加入，取酸介質為乳酸，其餘實驗條件均相同。酶解之後的處理以及膠原蛋白提取率計算均同上，以提取率為主要參考指標綜合選定最適用酶量。
1.3.4.4.2 ph值對提取率的影響
探索在酸介質的不同ph值下酶解對於膠原蛋白提取率的影響。進行六組實驗，每組取牛皮4g，取不同ph值分別為1.2、1.
6、2.0、2.4、2.
8、3.2的乳酸為酸介質，在其他條件均相同的條件下酶解。酶解之後的處理以及膠原蛋白提取率計算均同上，以提取率為主要參考指標綜合選定最適ph值。
1.3.4.4.3 酶解時間對膠原蛋白提取率的影響
**酶解時間對於膠原蛋白提取率的影響。由於酶解的時間一般比較長，因此進行10組實驗，每組取牛皮4g，分別在酶解2、3、4、5、6、7、8、9、10、11h 之後停止反應，其他條件均相同。酶解之後測定膠原蛋白提取率，以提取率為主要參考指標綜合選定最佳提取時間。
1.3.4.4.4 溫度對膠原蛋白提取率的影響
**胃蛋白酶的最適酶解溫度。進行8組實驗，每組牛皮4g，分別在4、20、25、30、35、40、45、50℃下，以乳酸為酸介質，其他條件均相同進行酶解。酶解之後測定膠原蛋白提取率，以提取率為主要參考指標綜合選定最適提取溫度。
王亞軍簡歷
簡歷姓名 王亞軍 性別 男 政治面貌 團員 畢業生院校 成都大學 位址 成都大學 出生日期 1990年2月 戶口所在地 四川省宣漢縣 136 e mail 專業 2010級材料成型及其控制工程 教育背景 2010 2014 主修材料成型及其控制工程專業 英語四級459分 交易65分 市場基礎知識76...
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