miRNA qPCR的重要貼士心得點評

摘要：pcr成為目前開展mirna表達譜分析的最常用方法。它靈敏快速，操作簡單。當然，若想獲得穩定可靠的結果，也須花費一番努力。

為此，exiqon公司的專家分享了成功開展mirna qp的五條重要建議，為大家的研究助力。

pcr成為目前開展mirna表達譜分析的最常用方法。它靈敏快速，操作簡單。當然，若想獲得穩定可靠的結果，也須花費一番努力。

為此，exiqon公司的專家分享了成功開展mirna qpcr的五條重要建議，為大家的研究助力。生物通

1. 選擇適當數量的重複

使用重複的目的是消除差異引起的噪音。取決於樣品的差異程度，它可能需要包含生物學和技術重複。具體需要哪種重複，這取決於實驗中引入最大變異的步驟。

樣品本身需要生物學重複，而rna提取、rt和pcr步驟需要技術重複。重複的數量取決於變異水平，但絕不能低於三個。如果只用了兩個重複，且它們差異顯著，那麼就很難確定哪個是異常值。

生物通2. 確定最佳的對照

在研究中應當使用陰性和陽性對照。陰性對照能用來顯示汙染，並確定每個分析的背景水平。使用哪個陰性對照要取決於實驗，但一般應包括：生物通

無酶對照：不含酶的rt反應，以檢查dna汙染

無模板對照：不含模板的rt或pcr反應，以檢查試劑是否存在汙染，並顯示引物二聚體生物通

mock對照：帶有載體rna（如ms2）的rt對照，以檢查提取過程中使用的載體或其他rna是否會增加背景

實驗中也應當使用陽性對照，以檢查樣品的質量，並進行troubleshooting。陽性對照可以是合成的rna spike-in。這是cdna合成反應的對照，也很容易判斷樣品中是否存在pcr抑劑

3. 開展反應的質量控制

為了開展質量控制，應當監控擴增子的熔解溫度（tm）和分析效率。mircury lna universal rt microrna pcr系統中使用sybr green檢測，這可以產生解離曲線，而不同執行之間特定擴增子的tm應當相同。因此，tm可用來驗證是否獲得了相同的擴增子。

解離曲線應當只有乙個峰，而不同儀器的tm可能會有差異，這是因為不同的溫度校準。

4. 選擇良好的參考基因

選擇最佳的參考基因或參考基因組合，這至關重要，它可實現mirna定量分析的標準化。如果利用含有幾百個mirna的分析板進行篩選，標準化的最佳方法是取所有表達mirna的平均值。在小型研究中，可使用乙個或多個穩定表達的內源對照。

這可從篩選研究中選擇。如果未開展此類研究，則應當從文獻中挑出一些候選參考基因。

5. 選擇優秀的資料分析軟體

適當的資料分析對您下結論很重要。利用高質量的資料分析軟體進行資料分析，如exiqon genex，可獲得正確的mirna圖譜。