第一章紫外可見分光光度法
紫外可見分光光度(uv-vis)是基於物質分子對200-780nm區域內光輻射的吸收而建立起來的分析方法。
一、紫外-可見分光光度法分類
1、目視比色法（由於欠準確，已不廣泛使用）
(2)測定方法
測定方法有標準色階法、比色滴定法。
a、標準色階法
b、比色滴定法
1、 分光光度法
應用分光光度計，根據物質對不同波長的單色光的吸收程度不同而對物質進行定性和定量分析的方法。
（1）可見分光光度法（400—780nm）
（2）紫外分光光度法（200—400nm）
(3)紅外分光光度法(～nm)
紫外、可見分光光度法的特點：
1、 靈敏度高
2、準確度較高
3、操作簡便、分析速度快
4、應用廣泛
二、基本原理
（一）物質的顏色與光有密切關係。
1、光的基本特性
a、電池波譜
光是一種電磁波，具有波動性和粒子性。
b、 單色光和互補色
具有一種波長的光稱為單色光，含有多種波長的光稱為復合光。
凡是能被肉眼感覺到的光稱為可見光(visible light)。其波長範圍：400-780nm。在可見光區內，不同波長的光刺激眼睛後會產生不同顏色的感覺，即具有不同的顏色，
如果把適當顏色的兩種光按一定強度比例混合，也可以得到白光，這兩種顏色的光稱為互補色光。
學習並掌握：光色互補示意圖
（二）物質對光的選擇性吸收
1、物質顏色的產生
當一束白光照通過某透明溶液時，若某溶液選擇性地吸收了可見光區某波長的光，則該溶液呈現出被吸收光的互補色光的顏色。
例如：kmno4（呈紫紅色？），k2cro4(呈黃色？)
2、物質的吸收光譜曲線
以波長（λ）為橫座標，以吸光度為縱座標做圖，可得一曲線，這曲線稱吸收光譜曲線。（它描述物質對光的吸收程度）
3、吸收光譜曲線產生機理
在實際定量分析中，待分析物一般都是混合物，其中以溶液為主。因此，溶劑效應對物質吸收帶影響是個很重要的問題，特別是紫外區的吸光譜。溶液中的吸收光譜和物質氣態光譜是不同的，在非極性溶劑中所得的光譜接近於氣態光譜。
而極性溶劑對溶質吸收光譜的影響極大。下圖可以明顯顯示出溶劑效應，庚烷極性小，其吸收光譜改變少，而乙醇極性大，吸收光譜產生了重要改變。這點對臨床檢驗工作有重要影響。
例如：nadh是檢驗工作中常用的底物，要計算k值時要用水溶液的吸光係數，而不要用其他體系的吸光係數。
三、朗伯-比爾定律
當一束平行的單色光通過均勻而透明的溶液時，一部分光被溶液所吸收，因此透過溶液的光通量就要減少。設入射光通量為φ0，通過溶液後透射光通量為φtr，則比值φtr/φ0表示溶液對光的透射程度稱為透射比，符號為t(或τ)，其值可以用小數或百分數表示：
t(或τ)=φtr/φ0
透射比倒數的對數表示溶液對光的吸收程度，稱為吸光度，用a表示。
a=lgφ0/φtr =-lg
當入射光全部透過溶液時φtr＝φ0。τ=1（或100%），即a=0；當入射光全部被溶液吸收時，φtr=0， =0，即a→∞。
1、朗伯（lambert）定律
推導得出：
ａ＝ｋ1b
上式為朗伯定律的表示式。
2、比爾（ｂeer）定律
推導得出：
ａ＝ｋ2c
上式為比爾定律的表示式。
比爾定律只適宜於一定的濃度範圍。
3、朗伯-比爾定律
物質對光的選擇性吸收遵守光的吸收基本定律――朗伯－比爾定律。
理論推導和實踐都證明：當一束平行單色光垂直入射通過均勻、透明的吸光物質的稀溶液時，溶液對光的吸收程度與溶液的濃度及液層厚度的乘積成正比。
即：（）
式中 b－吸收池內溶液的光路長度，cm；
c－溶液中吸光物質的濃度，
k－吸光係數。
4、摩爾吸光係數（ε）
當溶液的濃度以物質的量濃度（mol.l-1）表示，光程長度以厘公尺（cm）表示時，相應的吸光係數稱為摩爾吸光係數，以ε表示，其單位為
此時，朗伯-比爾定律改寫成：
四、 紫外-可見分光光度計的主要部件
紫外-可見分光光度計的主要部件包括光源、單色器、吸收池、檢測器及測量顯示系統。
1、光源（1）可見光光源
鎢燈（2）紫外光光源（多為氣體放電源）
氫燈、氘燈(重氫燈)或氙燈
2、單色器
單色器是將光源發出的連續光譜按照波長的長短順序分散為單色光，並能準確方便地「取出」所需的某一波長的光的裝置。
獲得單色光的元件有濾光片、稜鏡和光柵, 紫外可見分光光度計的色散元件,目前主要採用稜鏡和光柵。
（1） 稜鏡
（2）光柵
2、 吸收池（又叫比色皿，用於盛裝試液和參比溶液）
比色皿一般為長方形。有各種規格，
比色皿使用注意事項
3、 檢測器
對透過吸收池的光做出響應，並把它轉變成電訊號輸出，其輸出訊號大小與透過光的強度成正比。
分光光度計中的光電轉換元件有硒光電池、光電管、光電倍增管。
5、訊號顯示器（檢流計標尺）
測量的實驗資料如透光度t、吸光度a(或濃度c),其數值大多由數碼管顯示（數字顯示和自動記錄）,也有用指標式指示,其表頭刻有吸光度a和透光度t兩種刻度。
五、 紫外-可見分光光度計的型別及特點
1、單光束分光光度計
2、雙光束分光光度計
3、雙波長分光光度計
六、常用紫外-可見分光光度計的使用
1、可見分光光度計（721型分光光度計）
分光光度計的基本部件:光源 → 單色器 → 吸收池 → 檢測系統
如721型分光光度計是目前國內應用較多的一種簡易型分光光度計，它屬於單波長單光束型別，結構簡單、**便宜、操作方便，工作波長範圍是360-800nm。
2 、紫外分光光度計（75系列分光光度計）
紫外分光光度計一般有氘燈和鎢燈,波長範圍200~800nm (或更寬)。故準確的名稱應是紫外可見分光光度計。
75系列分光光度計
七、分光光度計的檢驗與維護保養
1、分光光度計的檢驗：
（1）、儀器波長的校正
a、儀器自動校正波長
b、鐠釹玻璃校正波長
許多分光光度計附帶有鐠釹玻璃,此玻璃在529nm有一吸收峰,將此玻璃插人吸收池架上,用無色玻璃或空氣作參比,將功能選擇放在t檔(或a檔),逐點測定其透光度t(或a)。
c、用已知最大吸收波長的溶液校正
（2）透射比正確度的檢驗
（3）吸收池配套性檢驗
2、分光光度計的維護和保養（p82）
八、紫外吸收光譜的定性分析
紫外吸收光譜可用於有機化合物的分析和檢定；同分異構體的鑑別；物質結構的測定等等
1、定性分析
定性分析：吸收光譜的特徵（形狀和 max ）
2、有機化合物分子結構的推斷
常見有機化合物紫外吸收光譜
（1）飽和有機化合物
飽和碳氫化合物只含有σ鍵, σ電子結合得很牢固,只有吸收很大能量才能產生σ→σ*躍遷,由於在遠紫外區(10～200nm)才有吸收,在200～1000nm範圍內不產生吸收峰。故這類化合物在紫外吸收光譜分析中常用作溶劑。但是當飽和碳氫化合物中氫原子被取代後,吸收峰產生紅移。
（2）烯烴
烯類化合物含有雙鍵,能產生→*躍遷。具有孤立雙鍵的烯烴,其吸收帶在220nm以下,例如乙烯的=165nm。
（3）炔烴
簡單的三吸收帶為173nm,屬→*躍遷。在共軛體系中有兩個烴基時,乙個顯著的特點是230nm左右產生一系列中等強度的吸收帶; 當這個體系增至3個以上三鍵時,在近紫外區產生兩個吸收帶,220～280 nm有強吸收.
（4）芳香化合物
苯的紫外吸收光譜是由→*躍遷組成的三個吸收帶，即e1、e2和具有精細結構的b吸收帶。當苯環上引入取代基時，e2和b吸收帶一般產生紅移且強度加強。
3、純度檢查
痕量雜質，如甲醇或乙醇中的雜質苯（無吸收＋有吸收）
利用摩爾吸光係數（雜質與樣品均有uv吸收）
4、計算不飽和有機化合物吸收波長（）的經驗規則
有機化合物在紫外區的最大吸收波長（），伍德沃德（woodward）和斯科特（scoott）對共軛二烯，多烯α、β不飽和羰基化合物，苯的取代衍生物進行了研究，獲得了一些經驗規則，根據有機化合物分子結構，計算出該化合物的最大吸收波長，與實測波長十分接近。
九、單組分體系定量分析
1、工作曲線法
採用一定容積的容量瓶（25ml、50ml、100ml）配一系列標準溶液，分別測定其吸光度，以濃度c（實際情況多以容量瓶中含溶質質量或在容量瓶中加入標準溶液的體積）為橫座標，以吸光度a作縱座標，在座標紙上繪製曲線（一般為一條通過原點的直線），稱它為工作曲線或標準曲線。
1 基本原理（顯色）
2 標準溶液的配製
③吸收曲線的繪製
以含fe3+標準溶液0ml的為參比，含fe3+標準溶液6.00ml為待測試液，在分光光度計上從波長450～550nm間，每隔20nm測定一次吸光度，在最大吸收波長左右，每隔5nm測定一次吸光度。以波長為橫座標，以吸光度為縱座標，繪製吸收光譜曲線，並找出最大吸收波長λmax。
④標準曲線的繪製
取配製好的一系列標準溶液，在最大吸收波長處測定其吸光度，以標準溶液濃度（實際情況多以容量瓶中含溶質質量或在容量瓶中加入標準溶液的體積）為橫座標，以吸光度為縱座標繪製工作曲線。
（直線回歸方程此處不講，將在今後的數理統計課程中介紹）
⑤樣品的測定
測出樣品溶液的吸光度ax，在工作曲線上找出相應的cx。從而求出樣品中待測物的含量。
（2）比較法
當被測樣品數量少，且吸光度a與濃度c的線性比列關係甚佳，可採用比較法定量。
根據朗伯-比爾定律，因測定的是同一種樣品，所以ε相同，用同一種型號的比色皿，則比色皿厚度l相同，此時，可由朗伯-比爾定律得：
第二章電位分析法
一、電化學分析法
1、定義：利用物質的電化學性質來測定物質含量的分析方法。
物質的電化學性質：物質(電解質)溶液通電時(形成電化學電池)其化學組成和和濃度隨電位、電流、電導或電量等電學特性而變化的性質。
2、分類：
(1)據濃度與某電學特性之間的關係進行定量分析。如利用能斯特方程式由電位值求濃度。
(2)據某電學特性在化學計量點的突變來指示滴定終點的到達，從進行定量分析——電容量分析。如電位滴定法
(3)通過電解將被測組分在電極上析出固體物質，稱量析出物的質量來計算被測物的含量——電解稱量分析。
3、電位分析：以測量電池電動勢或電動勢的變化來測定物質含量的一種分析方法。可分為直接電位法和電位滴定法。
直接電位法：根據測得的電位值來確定被測離子濃度的電位分析法。
電位滴定法：根據電位值的突變來確定滴定終點的滴定分析。以電位的突變來代替化學指示劑。
無論哪種分析法都離不開電化學電池。
4、電化學基礎知識：
原電池：
組成條件、判斷正負極的方法、正負極的反應、原電池的表示方法
例：（略）
由電池寫電極反應和總反應式：
(-)(pt) | sn4+(c1)，sn 2+(c2) || fe3+ (c3)，fe 2+(c4) | (pt)(+)
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