三、 瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr產物
1）配置用於灌注電泳槽和製備凝膠所需的電泳tae緩衝液；
2）按體積稱取1%(w/v)的瓊脂糖，加tae緩衝液；
3）在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解；
4）冷卻至60℃左右，加入eb溶液，使之終濃度為0.5ug/ml；
5）將溶液倒入膠膜中，插入膠疏，靜置冷卻；
6）待凝膠完全凝結後，小心將膠梳取出，將凝膠放入電泳槽中；
7）將樣品與緩衝液(loading buffer)充分混合後加入樣品槽；
8）接通電源，維持電壓120v，直到適當時間；
9）切斷電源，將凝膠於紫外燈下觀察，並用紫外成像儀拍照。
四、 dn**斷的**純化
採用takara agarose gel dna fragment recovery kit**純化dna。
1）dna樣品經瓊脂糖凝膠電泳後，將目的dn**斷切出。
2）將含有dn**斷的膠塊切碎後放入1.5ml的microtube中。
3）向裝有膠塊的microtube中加入約3倍凝膠量（體積比）的nai溶液(1mg凝膠視為1ul)，55℃加熱使膠塊完全融化。
4）按每20ul矽膠樹脂結合約1ug dna的比例加入適量的矽膠樹脂，充分混合後，於室溫放置20分鐘。
注）矽膠樹脂使用前，一定要充分混勻。
5）離心(10,000rpm、1分鐘)後除去上清液。
注）此上清液在整個**過程結束後，確認**率較高時方可廢棄。如果**率較低時，可在此上清液中再次加入矽膠樹脂液，重新吸附。
6）在microtube中加入500ul清洗液，振盪混勻後離心(10,000rpm、1分鐘)，除去上清液。
7）重複操作第6步。
注）為提高dn**斷的**效率，此時應盡量除淨上清液。
8）加入和矽膠等量（體積比）的te緩衝液或滅菌蒸餾水後混勻，55℃水浴中放置10分鐘。
9）離心（10,000rpm，1分鐘）後吸取上清液，注意盡量不要吸取矽膠樹脂。此**上清液即為dna**溶液。
注）為提高**效率，可再重複一次第8步和第9步的操作。
五、擴增的16s rrna基因轉殖於質粒載體上
擴增的16s rdna首先在0.8%低熔點瓊脂糖膠上純化，純化的dna和質粒pucm-t vector在16℃連線16h，然後轉化入 dh5α，轉化子在含x-gal和氨苄青黴素的lb平板上篩選。
1連線反應
基本操作按連線酶說明書進行，外源目的dn**斷與載體dna比例為3:1，按比例加入ddh2o，外源dn**斷，載體dna，連線緩衝液，t4 dna連線酶(promega)，16℃連線16hr，用瓊脂糖凝膠電泳檢測連線效果。
2大腸桿菌感受態的製備和質粒的轉化
（1）大量製備感受態細胞
1）從37℃培養12-16h的平板中用無菌牙籤挑取乙個單菌落，轉到含有3ml lb培養基的試管內，37℃振搖過夜。次日取菌液1ml接種至含有100ml lb培養基的500ml燒瓶中，37℃劇烈振盪培養約2-3h(振搖速度為200rpm)，待od600值達到0.3-0.
4時將燒瓶取出立即置冰浴10-15min。
2）自該步驟起皆需無菌操作。在無菌條件下將細菌轉移到乙個滅菌處理過的用冰預冷的50ml離心管中。
3）4℃離心，4000g×10min**細胞。
4）棄去培養液，將管倒置於濾紙上1min，以使最後殘留的培養液流盡。
5）加用冰預冷的0.1mol cacl210ml重懸菌體，置冰浴30min。
6）4℃離心，4000g×10min，棄去上清液，倒置於濾紙上1min。
7）再加4ml用冰預冷的0.1mol cacl2重懸菌體。（重懸時操作要輕）。
8）置4℃冰箱置12-16h，即可應用於轉化。
（2）感受態細胞的凍存
如一次製備出的感受態不能用完，可進行凍存保留。其方法為：將感受態分裝成400ul乙份，每份加30%體積的甘油儲存液。置-70℃冰箱，低溫儲存可達3個月之久。
（3）細菌的轉化
1）無菌狀態下取新鮮感受態200ul置於無菌的10ml玻璃試管中。如果使用凍存的感受態細胞時，則將其從-70℃冰箱取出，握於手中，待其解凍後立即吸取200ul轉移至10ml無菌玻璃試管中，剩餘的感受態可棄去，不能再凍存復用。
2）每管加質粒50-100ng，輕輕旋轉以混合內容物，在冰上放置30min。
3）42℃熱休克90s，不要搖動試管。
4）每管加無抗生素的普通lb培養基800ul，37℃搖床(100-150r/min)，溫和振搖45min。
5）用無菌彎頭玻璃鋪菌器將200ul菌液鋪於含氨卞青黴素(ap)的瓊脂平板表面，37℃平放20min，然後倒置培養10-14h。
3重組質粒菌落的鑑定
（1）重組質粒菌落的藍白斑篩選
含瓊脂的lb培養基在滅菌後，冷卻至55℃左右向100ml培養基中加入100ul的20gl-1 x-gal、100ul的100mm iptg以及相應抗生素，混勻後鋪成平板。取適量轉化後的菌液塗佈平板，37℃倒置培養過夜，即可長出藍白菌斑。在絕大多數情況下可以確定白色菌斑為插入目的片斷的陽性轉殖。
（2）重組質粒的酶切鑑定
用無菌牙籤挑取初步篩選到的陽性轉殖，在含有相應抗生素的平板上點種儲存，同時接種於含有相應抗生素的lb液體培養基中振盪培養，12-16h後提取質粒，並用相應的限制酶進行酶切鑑定。
六、質粒dna的提取與dna序列分析
從 dh5α細胞中提取含16s rrna基因的pucm-t質粒。純化的質粒pt-16s rdna作為dna測序的模板。
質粒dna的提取
溶液i：50mmol/l葡萄糖，25mmol/l tris-hcl(ph8.0)，10mmol/l edta(ph8.0)
溶液ⅱ：200mmol/l naoh，1%sds
溶液ⅲ：3mol/l醋酸鉀（ph4.8）
1）在15ml帶（鋁合金）蓋的試管中加入5ml含相應抗生素的lb液體培養基，接入一單菌落，於37℃，200rpm振盪培養過夜。
2）將1.5ml培養物倒入微量離心管，10，000rpm離心30秒，棄上清。
3）菌體沉澱重懸於150ul溶液i。
4）加入300ul溶液ⅱ，蓋緊管口，快速將離心管顛倒數次，以混合內容物；室溫下靜置3-5分鐘。
5）加入150ul預冷的溶液ⅲ，蓋緊管口，溫和地將離心管顛倒，旋轉數次，使溶液ⅲ在粘稠的細菌裂解液中分散均勻，之後將管靜置於冰上5-8分鐘。
6）12，000rpm離心5min，將上清轉移至另一離心管中。
7）加入等量酚：氯仿，振盪均勻，12，000rpm離心5min，將上層液體轉移到另一離心管。
8）加入2倍體積的無水乙醇，混合後置-20℃放置20分鐘。
9）12，000rpm離心8分鐘，小心棄去上清。
10）用500ul 70%乙醇洗dna兩次，小心棄去70%乙醇。將離心管倒置於吸水紙上，並使質粒dna沉澱塊乾燥。
11）加入30ul含無dna酶的胰rna酶（20ug/ml）的te，重新溶解質粒dna，置-20℃。
七、交由上海生工測序。
附：pcr引物設計見給你發的**。
細菌種屬的分子鑑定
9.加入50 l預熱 60 的洗脫緩衝液，室溫放置3分鐘。12000 rpm離心2分鐘，流下的液體即為基因組dna。10.電泳。取3 l溶液電泳檢測質量。二 pcr擴增 1.根據已發表的16s rdna序列設計保守的擴增引物。16s f 5 agagtttgatcctggctcag 3 16s r ...
常見細菌感染PCR鑑定流程
一 細菌核酸的提取 1.取1 ml培養肉湯13000 g離心10 min棄去上清。2.用1 ml蒸餾水洗滌細胞沉澱後再次13000 g離心10 min棄去上清。3.取200 ul instagene matrix bio rad 重懸細胞顆粒。注 採用平板培養時挑取單個菌落直接用200 ul ins...
一種快速鑑定細菌的方法
4.細菌染色體dna的快速提取 取1.5 ml離心管，稱重。在管中加入100 l緩衝液i，從平板上刮數環菌於其中，振盪均勻，9 000r min,3min。棄上清液，稱重，計算出菌體質量。按照每毫克菌體10 l的比例，在離心管中加入緩衝液 將菌體振盪均勻，放置於75 反應15min得到染色體dna粗...