沙門菌屬、志賀菌屬、侵襲性大腸埃希菌、腸產毒素大腸埃希菌是常見的引起人類和動物細菌性痢疾和細菌性食物中毒的腸道致病菌，嚴重的危害著人類健康和牲畜的安全〔1〕。因此，建立一種快速、簡便、準確、特異地檢測方法具有重要意義。目前常見病原菌的檢驗方法存在著檢測周期長、工作量大、所需試劑多，而且假陰性率高，靈敏度低，或假陽性率高，特異性差等缺點。
pcr技術提供了理想的檢測方法。本實驗採用多重pcr方法，可在同一反應體系中檢測不同的細菌，整個過程只需要2～3h，應用前景廣闊。
1材料與方法
1 1實驗菌株腸炎沙門菌、阿柏丁沙門菌，雞雛沙門菌，德爾比沙門菌、鼠傷寒沙菌，福氏志賀2a，福氏志賀2b，宋氏志賀菌，枸緣酸桿菌，變形桿菌，河弧菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌(四川省疾病預防控制中心)；產毒素大腸埃希菌c83921，產毒素大腸埃希菌c83902（中國獸醫藥品監察所）；侵襲性大腸埃希菌（中國生物製品研究所）。
1 2試劑染料、緩衝溶液、taqdna聚合酶、dntps、核酸染料(**)、瓊脂糖、marker等(北京塞百盛基因技術公司)。
1 3主要裝置pcr基因擴增儀、台式高速離心機、紫外可見凝膠成像系統、核酸分析儀、微量加樣槍(德國eppendorf公司)；電泳槽、dyy-2穩壓穩流電泳儀(北京市六一儀器廠)。
1 4方法
1 4 1引物設計沙門菌組氨酸轉運操縱子基因片段具有沙門菌屬特異性〔2-4〕，根據genebankv01373提供的基因序列設計引物，即引物1:5＇-actggcgttatccctttctctggtg-3＇；引物2:5＇-atgttgtcctgcccctggtaagaga-3＇由於ipah基因存在於所有志賀菌屬和侵襲性大腸埃希菌（eiec）的質粒和染色體上〔5〕，根據genebankm32063提供的序列設計志賀菌和eiec引物,引物序列為:
引物1：5＇-tgtatcacagatatggcatgc-3＇；引物2：5＇-tccggagattgttccatgtg-3＇。
選擇不耐熱腸毒素(lt)的編碼基因保守區〔6〕，根據genebanks60731提供的序列設計一對引物為：引物1：5＇-gcgttactatcctctctatgtg-3＇引物2：
5＇-agttttccatactgattgccgc-3＇。
1 4 2dna模板的提取採用熱裂解法，取細菌培養液1 0ml,置於eppendorf管中,8000r／min，滅菌蒸餾水洗滌2次,最後用1ml蒸餾水懸浮,隔水煮沸10min,8000r／min，離心10min,取上清,即為dna模板溶液。
1 4 3多重pcr擴增條件的優化通過多次試驗先確定了變化較小的因素buffer,dntp,再對影響較大的因素如mgcl2濃度、引物濃度、taq酶用量、模板濃度，在1個範圍內做正交實驗，再進行區域性微調，最後調整退火溫度和迴圈數引數等。取pcr產物5μl及dnamarker參照物在含有(**)的1%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓75v,電泳40min後在紫外燈下觀察結果。
1 4 4多重pcr體系的特異性、靈敏度、樣品檢測(1)特異性檢測：9株標準目的菌株和7株非目的菌株,提取dna模板,然後進行pcr擴增，電泳後觀察有無條帶的出現。(2)靈敏度檢測：
將從目的菌株提取的dna模板用核酸分析儀測定dna含量,然後作10倍梯度稀釋,取每個稀釋度的dna進行pcr擴增,電泳後觀察條帶的亮度,直到不出現擴增帶為止。(3)樣品的檢測：從牛肉中分離的可疑菌株,提取dna模板,進行多重pcr擴增。
同時,按常規進行生化檢驗和玻板凝集試驗。
1 4 5pcr試劑盒組成經反覆試驗,組裝多重pcr試劑盒。包括pcr反應管,pcr反應液〔染料，緩衝溶液（mg2+），dntp，引物〕,瓊脂糖粉,goldview染料，taq酶,陽性對照,陰性對照,液體石蠟。
2結果2 1pcr反應條件的優化反應體積50μl,10×buffer5μl，引物各0 25μl（50μmol/l）,taq聚合酶0 8μl(5u/μl),dntps2μl（10mmol/l）,粗提dna模板各1μl。擴增條件:94℃預變性4min,94℃變性45s,退火58℃40s,延伸72℃60s,32個迴圈，最後72℃保溫5min，見圖1。
1：腸炎沙門菌；2：阿柏丁沙門菌；3：
雞雛沙門菌；4：德爾比沙門菌；5：鼠傷寒沙門菌；6：
產毒素大腸埃希菌c83902；7：產毒素大腸埃希菌c83902；8：福氏志賀2a；9：
福氏志賀2b；10：宋氏志賀；11：侵襲性大腸埃希菌；12：
腸炎沙門菌+產毒素大腸埃希菌；13：產毒素大腸埃希菌+福氏志賀2a；14：腸炎沙門菌+福氏志賀2a；15：
福氏志賀2a+腸炎沙門菌+產毒素大腸埃希菌；16：腸炎沙門菌+產毒素大腸埃希菌+福氏志賀2a；17：腸炎沙門菌+產毒素大腸埃希菌+福氏志賀2a
圖1多重pcr反應檢測結果（略）
2 2特異性用所建立的方法檢測沙門菌、志賀菌屬、侵襲性大腸埃希菌、腸產毒素大腸埃希菌均擴增出特異的、與預期結果相符的dn**段,未見非特異性擴增帶，且其他的非目的菌株未擴增出條帶。
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