中醫動物模型的建立
【摘要】動物疾病模型主要用於實驗生理學、實驗病理學和實驗**學（包括新藥篩選）研究。人類疾病的發展十分複雜，以人本身作為實驗物件來深入**疾病發生機制，推動醫藥學的發展來之緩慢，臨床積累的經驗不僅在時間和空間上都存在侷限性，而且許多實驗在道義上和方法上也受到限制。而借助於動物模型的間接研究，可以有意識地改變那些在自然條件下不可能或不易排除的因素，以便更準確地觀察模型的實驗結果並與人類疾病進行比較研究，有助於更方便，更有效地認識人類疾病的發生發展規律，研究防治措施。
【關鍵詞】重要性特點應用存在問題
1 動物模型在科學研究中的重要性
1．1 避免人體實驗造成的危害動物可以替代人類作為實驗研究的物件，在人為特定的實驗條件下反覆實驗。有些實驗是沒有必要在人體直接開展的，更不能損傷人類致死。但是動物為了實驗目的需要可以損傷動物組織、器官以致處死，既要有科學性又要抵禦紫外線對**侵襲的能力減弱。
黃芪，入肺脾二經，甘、微溫、無毒; 具有補中益氣，養血活血，利水消腫，託膿生肌，固表止汗之功，為延年益壽強體質之要藥。現代藥理學研究發現，黃芪根含有大量具有抗自由基、抗氧化作用的黃芪甙、黃酮類化合物、皂苷等物質，其中黃芪總黃酮是一種良好的抗氧化劑，可清除多種自由基，而其正是通過對自由基的清除來發揮對紫外線損傷的防護作用［2］。黃芪醇提物的主要成分為黃芪總黃酮。
本次實驗從黃芪能夠清除自由基和提高sod 活性的角度，推測符合倫理性。
1．2 複製平時不易見到的疾病臨床很難見到放射病、毒氣中毒、烈性傳染病、戰傷等疾病，根據實驗要求能複製該疾病的動物模型，供研究使用。
1．3 建立發病率低、潛伏期長、病程長疾病的動物模型有些疾病如免疫性、代謝性疾病發病率低，我們可選用動物種群中發病率高的類似於人的疾病作為動物模型。還有些疾病如腫瘤、慢性氣管炎、遺傳病等發病速度緩慢，潛伏期長，在人類自身進行實驗研究實在有些困難。大多動物生命週期比較短，在短時間內進行一代或幾代的觀察就顯得十分容易。
1．4 增加可比性一般臨床上疾病是複雜的，多為零散發生，患者的年齡、性別、遺傳以及社會因素對其疾病的發生發展都有影響，在同一時期內，很難獲得一定數量的病例，而模型動物不僅在數量上容易得到
滿足，而且可以選擇相同品種、品系、性別、年齡、體重、健康狀態以及在相同的環境因素內進行觀察研
究，限制實驗的可變因子，排除其它影響因素，取得條件一致的、數量較大的模型材料，從而提高實驗的可比性，使得到的結果更準確。
1．5 標本收集方便動物模型作為研究人類疾病的「代替品」，可按研究者的需要隨時採集各種標本或分批處死動物收集標本，以了解疾病全過程，這是臨床不能辦到的。
1．6 全面認識疾病本質有些病原體不僅引起人類發生疾病，也可感染動物，臨床表現各有特點，通過對人畜共患病的比較，可觀察到同一病原體在不同機體引起的損害，更有利於全面認識疾病的本質。
2 中醫藥動物模型的特點
從中醫角度來看，通常動物模型均指病理模型，即人類疾病的動物模型。人類疾病動物模型是指生理醫學科學研究中所建立的具有人類疾病模擬性表現的動物實驗物件和材料。中醫實驗研究用動物模型有其獨特性，複製動物模型應遵循中醫理論，結合中醫自身發展規律，體現中醫特色。
「辨證論治」是中醫學的基本特點之一。「證」是中醫學對疾病發展過程中某一階段出現的病理概括，它包括病變部位、原因、性質和邪正關係的情況。「病」是指疾病的全過程，而「證」是反映疾病某一特定階段的病理變化的實質，是中醫理論的核心與精華。
建立各種中醫證的動物模型，已被視為實現中醫藥學規範化、客觀化乃至科學化的重要環節。中醫證候動物模型，是在中醫整體觀念及辨證施治思想的指導下，運用藏象學說和中醫**、病機理論，把人類疾病原型的某些特徵在動物身上加以模擬複製而成，且具有人體疾病症狀和病理改變相同或相似的證候動物［3］。病證結合動物模型，是證候動物模型發展的必然趨勢，疾病和證候是密不可分的，證候是疾病發生發展不同階段的表現，而這些不同表現有著相對獨立的病理改變。
證候動物的疾病模型需要進行嚴格的篩選，中醫證候大多是慢性過程，因此要選擇具有慢性時相的疾病模型，而急性的和具有自癒性的動物模型就不適合證候的研究。中醫藥研究動物模型的特點:相似性; 重複性; 可靠性; 適用性和可控性; 易行性和經濟性。
「證」的研究，是中西醫結合醫學的關鍵切入點，既要與現代科學的成果充分結合，同時要體現中醫的特色。用動物模型驗證中醫傳統理論的正確性，從而在動物身上發掘人體證候的本質，發現新的問題，探索新的規律，提出新的觀點，開發新的藥物。
3 中醫動物模型的應用
3.1中醫寒哮動物模型的建立
材料與方法
1. 動物清潔級健康雄性sd大鼠50只，體質量140－190g，購於江西中醫學院實驗動物中心，質量合格證：jzdw2007－226。
2. 試劑與儀器 ①試劑：卵白蛋白（ova，sigma公司），氫氧化鋁膠生理鹽水稀釋液100ml/瓶（黑龍江生物製品一廠)，0.
9%氯化鈉注射液500ml/瓶（安徽豐原藥業股份****無為藥廠），2％戊巴比妥鈉溶液，大鼠il-4和ifn-γelisa 試劑盒（r&d公司），地塞公尺松磷酸鈉注射液1ml/支；②主要儀器：402型超聲霧化器（上海魚躍醫療裝置****），電子天平（pg503-s，梅特勒公司），顯微鏡（ck40,日本olympus），離心機（j-2，beckman公司），酶
標閱讀儀（bio-rad550，usa），計算機影象分析系統（南京長信資訊系統公司）。
3. 動物分組方法將50只sd大鼠隨機分為5組，
每組10只。即：①a組：
正常對照組，給予生理鹽水腹腔注射、誘喘；②b組：西醫對照組，腹腔注射抗原液致敏，卵蛋白霧化吸入誘喘；③c組：中醫模型1組，腹腔注射抗原液致敏，以冷風誘喘；④d組：
中醫模型2組，腹腔注射抗原液致敏，卵蛋白霧化吸入誘喘，平喘後第7d，以冷風誘喘；⑤e組：中醫模型3組，腹腔注射抗原液致敏，卵蛋白霧化吸入誘喘，平喘後第14d，以冷風誘喘。
4. 造模方法
（1）哮喘西醫疾病模型的製作：參照文獻[1-3]方法並加以改進，建立大鼠哮喘模型。第1d分別予b、c、d、e各組大鼠腹腔內注射抗原液1ml（每ml含卵白蛋白100mg+氫氧化鋁100mg）使其致敏，至第8d重複注射1次加強致敏，正常對照組a組以生理鹽水代替抗原液腹腔注射。
兩周後激發哮喘時，分別把b、d、e各組大鼠置於自製半密閉鼠籠中，霧化吸入1%卵白蛋白生理鹽水40min。a組以生理鹽水代替卵蛋白霧化吸入，每日定時激發1次，連續4d。
（2）哮喘中醫證候模型的建立：①風寒因素的建立方法：將c、d、e組大鼠置於氣溫為（0±4）℃的環境中，給予空調強力冷風吹襲，持續時間40min，每日2次。
②中醫模型1組（c組）：於加強致敏後第4d給予冷風吹襲連續14d；③中醫模型2組（d組）：於1%卵白蛋白生理鹽水霧化吸入誘喘的第4d，誘喘後立即予地塞公尺松1mg/kg腹腔注射以平喘，平喘後第7d開始予冷風吹襲誘喘，連續10d；④中醫模型3組（e組）：
於1%卵白蛋白生理鹽水霧化吸入誘喘的第4d，誘喘後立即予地塞公尺松1mg/kg腹腔注射以平喘，平喘後第14d開始予冷風吹襲誘喘，連續10d。
5. 標本採集 ①肺泡灌洗液（balf）的製備：由於大鼠的肺葉分布與人類不同，右肺4葉，左肺1葉，且本實驗設計取右肺做病理研究，故對左肺進行單肺葉灌洗。
②balf細胞分析用標本的製備：balf離心取上清液後，立即取細胞沉渣做細胞總數計數，推片用瑞氏染液染色，分類計算嗜酸性粒細胞（eos）百分比。③組織標本的製備：
實驗結束時，各組大鼠摘取右肺組織，放入10%甲醛溶液固定。病理製作組織切片按常規脫水、浸臘包埋、切片、he染色進行，在光學顯微鏡下觀察組織形態學改變，並攝取**。
6. 指標檢測 ①大鼠balf中細胞分析：離心的balf沉渣，取0.
2μl高倍鏡下用細胞計數板進行細胞計數，另取沉渣推片，用瑞氏染液染色，高倍鏡下分類計算eos百分比。②elisa法測定大鼠balf中il-4、ifn-γ水平：取儲存於－20℃ balf標本，室溫下融化後，按試劑盒說明書elisa法測定il-4、ifn-γ的水平。
③病理切片的製作及光鏡觀察：取大鼠的右側肺組織的肺門段支氣管和右肺上葉，用10％甲醛固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，
石蠟切片5μm厚，作he染色，二甲苯透明加樹膠封片。鏡下觀察病理學改變。
7. 統計學方法實驗資料用x- ±s表示，多組均數比較採用方差分析和q檢驗，p＜0.05為差異有統計學意義，所有統計學分析和資料處理均在spss13.0統計軟體上進行。
結果1. 大鼠balf細胞分析結果見表1。b、c、d、e組balf中細胞總數和eos百分比均較a組公升高，與a組相比有明顯差異（p<0.
01），且c組大鼠balf中的細胞總數和eos所佔比例明顯高於b組（p<0.01）。
2. elisa法測定大鼠balf中ifn-γ、il-4水平見表2。採用雙抗夾心elisa法，檢測大鼠balf中ifn-γ、il-4水平。
b、c、d、e組大鼠balf中ifn-γ的含量與a組比較均降低，差異有統計學意義（p<0.01）；c組與b組組間比較存在明顯的差異（p<0.05）。
b、c、d、e組大鼠balf中il-4的含量與a組比較均公升高差異有統計學意義（p<0.01）； c、d、e組與b組il-4的含量差異均具有統計學意義（p<0.05，p<0.
01），且以c組的差異最為明顯（p<0.01），同時d、e組與c組組間比較具有顯著性差異（p<0.05）。
3. 肺組織病理形態學觀察見圖1-圖5。a組：
鏡下可見氣管、各級支氣管及肺泡、肺泡間隔形態結構正常，無充血、水腫，滲出物較少。b組：鏡下可見以嗜酸性粒細胞、淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤，氣道壁明顯增厚，氣道黏膜皺襞增多且不規則，氣道腔內上皮脫落、受損，氣道壁不完整。
中醫模型組：鏡下可見肺組織中大量以嗜酸性粒細胞、淋巴細胞為
主的炎性細胞浸潤，炎性細胞密集，肺泡及間質充血、水腫，支氣管、微血管可見明顯增厚及結構破壞，支氣管內可見痰液栓，氣道黏膜下組織水腫，微血管通透性增加，支氣管平滑肌痙攣，纖毛上皮脫落，管腔阻塞等。以上病理改變中醫模型c組較中醫模型d、e組為嚴重。
4 中醫動物模型研究存在的問題
製造中醫「證」的動物模型是一項複雜且有難度的課題，國內外尤其國內醫學研究人員做了大量的工
作，取得了一定的成績，但也遇到了問題，有以下幾個方面:
4.1 動物模型難以用「四診」方法辨證和評價療效「四診」是中醫學的診法，主要包括望、聞、問、切。通過四診在患者身上可以得到完整的病例資料，並做出準確的辨證診斷，但是對動物模型要想得到四診資料並作出辨證診斷，困難較大，動物既不能描述主觀感受，又無法進行脈診、舌診，這樣給中醫「證」的研究帶來很大的麻煩。
應加強對中醫「證」動物模型本質的研究，應用現代先進的裝置和技術手段，制定出動物模型的各項定量、半定量客觀指標，以便進行準確的辨證診斷，進一步深入「證」的研究。
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