摘要：採用燭缸培養，模擬微需氧條件，通過單因子試驗統計分析，**不同因素對幽門螺桿菌(helicobacter pylori, hp )生長的影響，改良了適於幽門螺桿菌液體培養的方法。結果表明，在適宜的燭缸培養條件下，hp能夠在新增β-環狀糊精的布氏肉湯中很好地生長。
關鍵詞：幽門螺桿菌，液體培養，燭缸法
幽門螺桿菌(helicobacter pylori, hp ) 已被證實是慢性胃炎及消化性潰瘍的主要**, 且與胃癌的發生密切相關。hp培養是研究hp的基本方法之一。傳統方法都是採用固體培養，存在著環境要求高，所獲菌量少，費時費力等諸多缺陷。
為了深入研究hp的致病機制，分析毒力相關蛋白，必須實現幽門螺桿菌的液體培養以獲取大量hp菌體，並為下一步開展hp的蛋白質組學研究和疫苗學研究奠定基礎。本實驗通過對傳統的燭缸法以及磁力攪拌加以改良創新進行搖菌液體培養，並篩選幾種比較適合hp液體培養的培養基，對其他幾個可能影響培養效果的因素加以探索，動態測定od600、菌體濕重和染色觀察液體培養的產量和對hp形態的影響。
1 材料與方法
1.1 菌種幽門螺桿菌臨床株t119、n76 均由我室從臨床胃病患者的胃鏡活檢組織分離培養所得, 經染色、脲酶試驗以及pcr 鑑定, 液氮儲存。胃鏡標本來自我校附屬第一醫院胃鏡室。
國際標準株nctc11637，j99購自
1.2 培養液
基礎培養液：（1）腦心浸液37mg/ml,（2）m ueller-h inton bro th (mhb )21mg/ml,以上兩種試劑購自公司，（3）布氏肉湯（配方
以上培養液均加入抗生素混合物(100ml 含tmp 50mg ,萬古黴素60mg ,多粘黴素b2500iu ,兩性黴素20mg) 。
新增成分：β-環狀糊精（0.2%），胎牛血清（ ）
1.3 儀器
ge ultrospec 2100prouv/visible spectrophotometer紫外分光光度計、燭缸、 ml平板、ika ks 260 basic搖床、olympus生物顯微鏡、磁力攪拌器（品牌名）
1.4 培養方法
在平板中加入10ml培養液，接入相應濃度的菌液，將平板固定於燭缸中，在燭缸中放入幾隻點燃的蠟燭，用真空脂將燭缸密封，通過蠟燭耗氧燃燒使缸內氣體環境達到適宜hp生長的微需氧條件，將燭缸固定於搖床上，恆溫37 ℃振盪培養。
1.5 檢測方法
od值測定：以同種培養條件下未加hp的液體培養基作為空白對照，每隔4～6h取樣 ml加入 ml相應培養液，在紫外分光光度計600nm波長下測定其吸光度值。
1.6 最適培養液選擇
將107cfu/mlhp菌液 ml分別接種於10ml以下培養液中：布氏肉湯、布氏肉湯+β-環狀糊精、布氏肉湯+胎牛血清（9：1）中、mhb、mhb+β-環狀糊精、mhb+胎牛血清（9：
1）、腦心浸液、腦心浸液+β-環狀糊精、腦心浸液+胎牛血清（9：1）。轉速100r/min, 37 ℃微需氧培養。
每隔4～6h測定od600，塗片革蘭染色觀察形態。
1.7 最適菌種選擇
在相同條件下培養幽門螺桿菌臨床株t119、n76，國際標準株nctc11637，j99。分別加入到10ml布氏肉湯+胎牛血清培養液中，微需氧條件下37 ℃、100r/ min培養，每隔4～6h測定od600 , 塗片革蘭染色觀察形態。
1.8 不同接種量對菌體產量的影響
分別將106 cfu/ml 、107 cfu/ml 、108cfu/ml和109cfu/ml 不同濃度的hp 菌液各 ml種於10ml 培養液中,微需氧條件下37 ℃、100r/ min 振盪培養。每隔4～6h測定od600 , 塗片革蘭染色觀察形態，確定hp 菌株的最優接種濃度。
2 結果
2.1 最適培養液選擇結果
結果見圖1。
2.2 最適菌種選擇結果
2.3 不同接種量對菌體產量的影響
3 討論
幽門螺桿菌是一種營養要求很高的微需氧菌，一般培養條件下不能生長。目前，針對hp的固體培養方法已經較成熟，但是，液體培養尤其是用於大規模培養的方法仍存在許多問題。傳統的燭缸法一直作為簡便易行的固體培養微需氧發生器，本實驗將其改良以適合液體培養，並通過研究調整多種影響因素使之進一步優化，以建立一種適用於普通實驗室開展的簡便、易行、經濟的液體培養方法。
本實驗採用單因子試驗統計分析技術，即固定其它條件逐個選擇某個因子的最佳條件，最終選出每個因子的最佳條件組成最優培養液和培養條件。結果表明，在適宜的培養條件下，hp能在新增胎牛血清的布氏肉湯中很好地生長。
適宜的培養條件是hp生長的重要因素，其中最初的接種量和氣體條件是最關鍵的影響因素。在hp液體培養研究中，我們發現最初的接種量是影響hp 生長的重要因素。不同的接種量決定著hp 的不同生長速度,接種量越大,最大生長量所需的時間越短。
本方法的最適接種量為109cfu/ml ,因為其最大生長量所需的時間最短。hp生長過程中的換氣也十分重要。hp 生長需不斷消耗o2 和co2 ,使微需氧條件發生改變,可直接影響hp 生長速度和最大生長量。
應用燭缸法每4~6h開缸一次,使hp 生長的氣體條件得到改善,進而促進hp 生長。通過實驗，得到了較穩定的hp液體培養條件，使得大規模培養hp成為可能。
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