維生素b7（生物素）檢測試劑盒實驗操作流程
一、實驗前準備工作
1、滅菌（在做實驗前，至少提前兩個小時以上滅菌）
如果有一次性無菌注射器則不需要滅菌注射器
沒有槍頭盒時用其他器皿裝槍頭一起滅菌（如燒杯，滅菌時放入槍頭後用報紙把燒杯口封起來），同時帶兩把小鑷子，做實驗時取槍頭用。
2、配製溶液
（1）準備10mlhcl溶液：1.0mol/l
（2）配製氫氧化鈉溶液：1mol/l
a）稱取0.4 g 氫氧化鈉
b）用10 ml雙蒸水或去離子水充分溶解
注：用帶橡膠塞的玻璃瓶儲存。
3、實驗過程中需要的其他裝置及器材：
無菌工作台
酶標儀(540nm或630nm)
37℃黑暗條件下的培養箱
95℃水浴鍋（實驗前需要提前加熱到95℃）
振盪器ph測量儀或ph試紙
雙蒸水0.2um無菌濾膜
酒精棉二、樣品處理
1、稱取1g奶粉樣品至乙個50ml無菌試管中，加入40ml無菌水搖勻，用hcl或naoh調整ph值到8.0 ＋/- 0.2，充分混勻；
2、在95℃水浴中提取30分鐘，期間所有樣品試管需每隔5分鐘振盪一次，並一直保持試管塞緊閉
3、迅速冷卻至室溫（即把樣品試管放進水裡，保證試管塞緊閉）
從下面這一步開始需要在無菌工作台進行
4、分別取1ml樣品用0.2um無菌濾膜過濾至1.5～2.0ml無菌試管中
5、根據樣品中生物素含量用試劑盒中提供的無菌水進一步稀釋樣品，稀釋後的樣品即可用於檢測。
樣品稀釋倍數計算如下：
例如：固體樣品標註濃度為80ug/100g
用該濃度除以標準2
計算： 80 μg ÷ 0.24 μg ＝333
結果為稀釋倍數大約為300
→ 1 ：300 稀釋
稀釋步驟：
a) 1 ：9（100ul樣品提取溶液 ＋ 900ul試劑盒中的無菌水），
b) 1 ：9（100ul a液 ＋ 900ul試劑盒中的無菌水），
c) 1 ：2（200ul b液＋ 400ul試劑盒中的無菌水）
注：每一步稀釋都需要充分混勻後再做下一步稀釋，提取稀釋液需立即使用。
三、檢測過程
1、配製標準品
裝有無菌水的瓶子：推開藍色帽，沿著玻璃邊緣垂直向上拉開，丟棄。
標準品必須在試驗之前新鮮製備。
－開啟生物素標準品瓶，取出蓋子。丟掉蓋子和紅色塞子
－加入x ml無菌水，至標準品瓶中。充分溶解標準品，即配成標準品濃縮液。
注：x詳見質控報告和標準品包裝標籤，每一批次所加體積會略有不同，無菌水必須是取自試劑盒中提供的。
－取6個無菌管（1.5～2.0ml）並按照下列**準備標準品溶液。
注：配製每乙個標準品，都是取標準濃縮液進行稀釋。
2、製備生物素培養基
注：培養基必須在試驗之前新鮮製備。
—開啟瓶蓋用鑷子從乾燥劑中取出培養基，丟掉乾燥劑。
－加入10ml無菌水（必須取自試劑盒中）至生物素培養基中。
－蓋好培養基瓶，充分搖勻。
－在95℃水浴中加熱至少5分鐘，期間振盪至少2次，保證瓶子封閉。
－迅速冷卻至室溫（低於30℃）。
－使用0.2μm無菌濾紙過濾培養基至15ml無菌離心管中。
3、檢測過程
－取出當次實驗需要數量的微孔板條，並固定在板上，未使用的微孔板條立即放回原來的箔袋中，並與乾燥劑一起重新封好，儲存在2-8℃條件下。
－用移液槍取150μl生物素培養基至微孔中
－用移液槍取150μl標準品或樣品至指定的微孔中
－用粘合箔蓋住微孔條或微孔：用手或壓舌板將粘合箔平壓，使其充分封閉微孔板條。
注意：保證粘合箔和微孔的封閉性，特別注意微孔的邊緣部分。
－在37℃黑暗條件下（可用孵育器）孵育44～48小時。
注：37℃孵育不能超過48小時。
以兩次平行、兩個樣品為例，取兩條微孔板條，每孔加樣如下:
4、讀取資料
－再次向下擠壓粘合箔，將微孔板向上放置在桌面上，在桌面上來回振盪，使微生物溶解在培養基中
－從對角開始小心揭去粘合箔，從左邊開始進行；
－微孔液體表面有泡沫時可以用移液槍頭去除
－用酶標儀630nm（或540nm）條件下讀取渾濁度
四、結果計算
推薦在計算結果時使用專業計算軟體。並使用4引數計算公式進行結果計算。
判斷檢測結果有效：
－od空白值 < od標準1
－od標準5 > 0.6 od
從標準曲線上讀取的濃度×稀釋倍數
樣品中生物素含量
（μg/100ml樣品總量 g（ml）
（μg/100g）
注：稀釋倍數為樣品處理過程中所計算的整數倍，不包括提取過程中的40倍，這個倍數已經在曲線中考慮進去。
例如：樣品重量1 g
樣品提取稀釋倍數1：40（不需要被考慮進去）
其它稀釋倍數1：300（必須考慮）
從標準曲線中讀取濃度值： 0.24 μg /100 g（ml）
0.24 ×300 / 1 = 128 μg / 100 g（ml）
五、實驗注意事項
1、試劑盒應存放在2－8℃條件下。
2、微孔板操作時使用的必須是無菌樣品提取液或稀釋液，並且樣品稀釋時需要使用盒中提供的無菌水。
3、樣品提取和稀釋必須在無菌條件下進行。
4、檢測培養基有可能刺激眼睛、**和黏膜。
5、完成試驗後須根據規章處理檢測儀器（如使用高壓滅菌鍋）。
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