萬方資料
時珍國醫國藥２００７年第１ｓ卷第９期
ｍａｔｅｒ工ａｍｅｄｉｃａ肛仉．１８
ｎｏ９一ｈｃｌ．１０㈣擴高鹽ｔｅ緩衝液
刪ｏｌ，ｌｅ叭
１．１．２儀器萬能研究顯微鏡蚰峨）；他ｌ—１６ｇ型台式高速離心機（上海醫用分析儀器廠）；ｈｈ一４２型快速恆溫數顯水箱（常州國華電器****）；ｕｖ一２４０紫外分光光度儀公司）；２４００型ｐｃｒ儀（ｇｅｉｌｅａｍｐ公司）。凝膠電泳儀（ｄｙｙ一ⅲ３３ａ型，北京市六一儀器廠）。
１．１．３材料材料採自天津、河北省、江西省和北京植物園等地。材料**見表１。
襄ｌ材料**
材料果集地點
採集時間
鑑定人玉竹ｐ礎刪ｃ帆
北京植物園（栽培）
２。０４—６張攻黃精ｐ
３出刪北京植物園（栽培）２００４—６
張攻長梗黃精只肭
江西省九江２００４—９譚策銘小玉竹只＾叭出
北京植物罔（栽培）２００５—６
張攻小玉竹ｐ脅出
貴州省２００５—９
張攻多花黃精ｐ帥帆
扛西省九江２００４—９
＿ｉ覃策鑽多花黃待只忡一
貴州省２∞５一ｌｌ
張攻鯗笪董擔墨竺生堂！竺
重型笪：鯉！＝！！壁墮
２方法２．１顯微鑑定擷取ｌ一２唧３的根莖，置於ｆ．ａ．ａ尉定液中固
定２４ｈ。取出後經一系列濃度的乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚度確定為１５鬥ｍ。用ｌ％番紅、２％淡綠染色２４ｈ，中性樹膠封片，拍照（橫切放大倍數１００×，針晶放大倍數４００×）。
２．２提採樣品的ｄｎａ取０．１ｇ植物根莖置於一８０℃預凍４０ｍｉｎ，待藥材充分變硬、變脆，置於白瓷乳缽研磨，加入ｃｒａｂ提取液（含２％二巰基乙醇），於６５℃消化６０ｍｉｎ，不斷振盪，充分反應，加入等體積ｃｈｃｌ３：異戊醇溶液離心
５ｍｉｎ，取上層液加人１／１０個體積６５℃預熱的ｃｔａｂ／ｎａｃｌ溶液，加入ｃｈｃｌ，：異戊醇溶液（２４：１）提取離心５ｍｉｎ。取上層相加等體積ｃｔａｂ沉澱液後於６５℃水浴
一離心１０
ｍｉｎ，取沉澱加入５（】ｏ山高鹽＿ｉｅ溶液，混勻，再加入
０．６個體積一２０℃預冷的異丙醇，振搖離心１５
ｍｉｎ，取沉澱，用８０％乙醇清洗，揮幹，用砸（１０，１）溶解，得ｄｎａ
儲備液。將儲備液稀釋成５ｌｌｇ－止一的模板ｄｎａ，置於一２０℃備用。
２．３引物篩選及ｒａｐｄ分析」心１選取２３條隨機引物，分別放人反應體系並按照下列比例，加入其它組分，其中模板ｄｎａ濃度為５ｎ昏／山。
ｒａｐｄ擴增反應總體積為２５．２山：５山５ｎｇ／鬥ｌ模板鬥巾ｏｖｌ引物，２．５山各為山ｐｃｒ緩衝液，３扯鈾酶、９．５鬥ｌ高壓水，混勻，擴增。擴增程式：
第ｌ階段，預變性９４℃，３ｍｉｎ；第２階段．每個迴圈９４℃變性１ｍｉｎ，３７℃遇火１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ．共４０個迴圈；第３階段，７２℃繼續延伸４ｍｉｎ；４℃儲存。
配製１．８％瓊脂糖凝髒（古ｅｂ），在１ｘｔａｅ緩衝液中電泳，電泳電壓７０ｖ，凝膠成像分析系統拍照。選取擴增效果較好的引物用作最終的分析。
２，４顯微鑑定結果長梗黃精與黃精、多花黃精的顯微特徵極為相近，中柱維管束多為周術型或不完全周術型，少見外韌型。所採植物牯液細胞的大小、多少以及針晶束的大小，多少隨種類、採集地點的不同而改變。可採用顯微鑑定對其進行大體上的區分，然後從分子水平上對其差異進行研究。
見圖ｌ一２。
２．５ｒａｐｄ擴增圖譜通過多次重複實驗，選取結果穩定、重現
性好的序列作為ｒａｐｄ分析的引物。見圖３。
用引物擴增，在１０００一２０００ｂｐ，長梗黃精沒
２１５０
有譜帶．江西產多花黃精有一條譜帶．貴州產多花黃精有兩條譜帶，可以區分多花黃精與長梗黃精，同時江西與貴州產多花黃精譜帶不同，很可能存在種內分化。用引物擴增，在黃精得到ｌ條譜帶．長梗黃精得到２條譜帶，可作
為鑑別黃精與長梗黃精的依據。用引物ｇｃｔｅｃ冊ｇａｃ擴增，黃
精與多花黃精、長梗黃精潛帶位置和數目仍然不同，可作為區分所採樣品黃精、多花黃精與長梗黃精的分於生物學依據。
圈ｌ多花黃精ｐ叩協＂ｍｎ
囤２長梗黃精ｐ．正ｆ曬
１．捲葉黃精
２．多花黃精（貴州）３小玉竹（貴州）４．小玉竹（北京）５．多花黃精（九江）６長梗黃精（九江）
７．栽培黃精
８．栽培玉竹
９ｍ址ｋｅｒ
囤３ｒａｐｄ分析的瓊脂糖電泳圖譜
３討論ｒａｐｄ是２０世紀９０年代發展起來的分子標記技術，能客觀地揭示供試材料蠲ｄｎａ的差異，操作簡便、快速，多型帶數目多，高質量的ｄｎａ是整個分析過程中最關鍵的一步，大量實驗發現，選採樣品內部組織，用乙醇浸泡、蒸餾水清洗，可除去任何可能的外源ｄｎａ，防止汙染。樣品可置於一８０℃，充分粉碎細胞壁，即使部分樣品放置一年以上，仍可提取到足夠量的ｄｎａ進行分子生物學分析。
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的應用和開發前景。
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