在基因調控領域，可以說沒有比表觀遺傳學更熱的話題了。而染色質免疫沉澱chip是表觀遺傳學研究中最常用的技術。
生物通報道：在基因調控領域，可以說沒有比表觀遺傳學更熱的話題了。而染色質免疫沉澱chip是表觀遺傳學研究中最常用的技術。
chip通過針對染色質相關蛋白（組蛋白、轉錄因子等）的抗體，來鑑定與該蛋白（或蛋白修飾）相連的序列。這種方式能夠幫助人們定位基因組中發生的表觀遺傳學改變。舉例來說，針對h3k4me3（賴氨酸-4上的組蛋白h3三甲基化）的抗體可用來檢測活躍表達的基因，而針對h3k27me3的抗體可用於檢測沉默的基因。
類似的技術還包括rip（rna免疫沉澱）和medip（甲基化dna免疫沉澱）。rip可以幫助人們鑑定，與特定rna結合蛋白相連的rna。而medip技術允許研究者pull down甲基化的染色質序列。
這些方法的原理都很簡單，但實際操作卻並不容易。「chip的過程往往相當複雜，而且可能十分冗長，」thermo fisher公司的蛋白生物學研發經理barbara kaboord說。
一、提高染色質的質量
與絕大多數實驗方法相同，核酸ip也遵循著gigo原則（garbage in, garbage out）。如果你的染色質原材料不佳，當然也就很難得到理想的實驗結果。
「獲得染色質很簡單。不過要獲得適用於chip的染色質就是另一回事了，」emd millipore公司的表觀遺傳學研發帶頭人john rosenfeld說。
人們一般通過超聲將染色質打成幾百bp長的片段，但超聲很難控制。超聲時間過長或力度過強都會令蛋白變性，使其與核酸分離或者破壞抗體識別的抗原表位。這種方案需要進行大量的優化，但過多的引數往往令人難以下手。
除超聲之外，也可以利用酶進行片段化。這種方案不僅更加簡單溫和，可重現性也更佳，cell signaling technologies（cst）公司負責chip產品研發的chris fry說。
cst的******chip和******chip plus enzymatic chromatin ip試劑盒使用微球菌核酸酶，據稱這種試劑盒能讓使用者簡單控制所得片段的大小。「我們將試劑盒用於二十多種不同的細胞系和組織，都得到了同樣長度的片段，」fry說，只要使用者保證酶與細胞數的比例不變。
thermo的pierce magnetic chip試劑盒也使用微球菌核酸酶，不過該產品還包括乙個可選的超聲步驟，公司的蛋白生物學研發經理barbara kaboord說。在這種情況下，超聲更多的是用來增加敏感性而不是進行片段化，它有助於從細胞核釋放更多的染色質，kaboord解釋道。他指出，新使用者可能會更適應單純的酶學操作，因為那樣更為簡單直接。
酶學片段化方案也存在著一定的弊端，life technologies的科學家loni pickle說。因為核酸酶有時會表現出序列偏好，從而影響結果的真實性。另外，酶學消化也並不總能與甲醛交聯（chip的乙個關鍵步驟）相容。
最後，她指出「對片段大小進行優化也稍顯困難。」
pickle還強調，鑑於目前廣為接受的是超聲法，使用酶學消化的研究者們需要做更多的工作，來保證酶學消化對結果沒有影響，。」
對於那些選擇超聲法的研究者們，rosenfeld指出了四個需要考慮的關鍵引數：細胞密度、超聲力度、超聲時間和迴圈數。「但不要同時對幾個引數進行優化，」他提醒道。
二、保證抗體的質量
用來進行pull-down的抗體，是成功核酸ip的另乙個關鍵因素。rockland immunochemicals公司的研發主管karin abarca heidemann介紹道，與western blot相比核酸ip對抗體的要求更多。舉例來說，western blot抗體識別的是變性蛋白。
但「在chip應用中，你需要確保抗體識別蛋白的**結構或者乙個暴露的抗原表位。」
最好的辦法是選擇一款經chip（或rip或medip）驗證的抗體。例如，rockland公司提供的表觀遺傳學產品epi-plus就是一系列已驗證的抗體。據abarca heidemann介紹，epi-plus系列抗體在多種實驗中進行過驗證，包括western blot、免疫組化、免疫螢光、免疫沉澱和chip，每個抗體的驗證時間長達三到四個月。
據fry介紹，cst也對抗體進行了大量的驗證工作，考慮了可能影響蛋白表達、定位或修飾的許多因素，包括高/低表達的細胞、rna干擾、表達載體等等。該公司甚至使用多肽晶元來評估組蛋白修飾抗體的特異性。「我們不應滿足於western blot的結果，」他說。
「抗體在越多實驗中表現出特異性，就越能靶標到正確的靶點。」
「確保獲得高質量的抗體，可能是chip實驗中的最大難點」emd millipore公司的rosenfeld說。該公司不僅有經chip驗證的抗體（chipab+），還提供用於rip的ripab+。
靶標5-甲基胞嘧啶（5-mc）或5-羥甲基胞嘧啶的抗體，可以用來富集甲基化dna。（例如，active motif公司提供的medip和hmedip試劑盒。）除此之外，你也可以通過甲基結合蛋白（mbp）來進行富集，這樣的技術常被稱為mira（methylated cpg island recovery assay）。
active motif公司的methylcollector ultra試劑盒就是利用這些蛋白來富集甲基化序列。
據active motif公司的產品經理kyle hondorp介紹，抗體和mbp之間的主要差異在於，5-mc抗體識別單鏈dna中的甲基化標籤，而mbp與雙鏈分子相互作用。
研究rna-蛋白互作也有許多可供選擇的工具。傳統rip從本質上來說就是不含交聯步驟的chip，包括emd millipore在內的許多公司都提供相應的抗體和試劑盒產品。另外，iclip技術可以幫助人們定位rna序列之間的相互作用。
active motif公司的rna chip-it試劑盒，專用於研究rna與細胞核染色質的相互作用。據rosenfeld 介紹，emd millipore公司也即將推出兩個類似的試劑盒，其中乙個包含交聯步驟以鑑定較短暫的相互作用。
如果你對某種rna感興趣，希望尋找與其發生相互作用的蛋白，那麼chirp、chart和rap都能滿足你的需要。這些技術對目標rna的互補寡核苷酸進行生物素標記，並由此捕獲與目標rna關聯的蛋白。pierce的magnetic rna-protein pull-down試劑盒，允許使用者給磁珠附上特定rna作為誘餌，捕獲與其發生互作的蛋白。
這些蛋白之後可以通過western blot和質譜分析進行鑑定。
三、控制細胞數
chip一般使用體外培養的細胞，每次反應所需的細胞量在一百萬到一千萬之間。現在，人們常常需要研究更為特殊的樣本，例如腫瘤、組織活檢樣本、幹細胞、已存檔的ffpe樣本（甲醛固定石蠟包埋）、流式細胞分選或雷射捕獲顯微切割所富集的細胞。在這些情況下獲得一百萬細胞並不容易。
實驗所需的細胞量取決於研究的物件，kaboord說。組蛋白修飾比較豐富，需要的樣本量也就相對較少。而轉錄因子豐度較低，一般需要大約一百萬細胞，不過「如果訊雜比高，那麼樣本量也可以適當減少。
」rosenfeld解釋道，chip過程中的高背景，決定了細胞數量的高要求。不過，**商們也在不斷優化著自己的試劑盒，以便處理更小的樣品量，並獲得更好的結果。他們採取的策略大多是優化緩衝液，或者用磁珠取代多孔的瓊脂糖。
emd millipore的magna chip hisens高靈敏度試劑盒，減少了緩衝液中的去汙劑成分，採用了防止粘附的矽化試管，並且在洗脫步驟之前整合了「tube switch step」。現在，該試劑盒研究轉錄因子只需要十萬細胞，研究組蛋白修飾只需要一萬細胞。
酶學片段化比超聲法所需的細胞更少，fry說，這是因為酶學方法更為溫和。據介紹，cst公司的******chip plus enzymatic chromatin ip試劑盒需要四百萬細胞，用乙個15cm培養皿上的粘附細胞足以進行三次ip。「對於組蛋白而言，細胞量少十倍仍可以得到很好的訊號。
」現在，chip方案變得越來越簡單，實驗通量也越來越高。據pickle介紹，以往一次chip實驗可能需要數天。而life technologies的magnify chip試劑盒只需要五個小時，而且能夠進行擴充套件以適應大量的樣本。
儘管不斷被優化，大多數chip產品的基礎方案並沒有出現大的改變，一般還是用磁珠捕獲抗體-磁珠複合體。不過，已經有一家公司開發出了另一種方案。
porvair sciences公司的chromatrap採用蛋白a/g偶聯的biovyon過濾裝置，對抗體複合物進行捕獲，整個過程無需磁珠。據該公司ceo ben stocks介紹，這個產品需要的起始樣本更少，從開始到結束只需要五個小時，不僅產量提高25倍還可以相容自動化工作流程。目前，該產品有spin column柱和微孔板兩種形式。
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