原核表達之目的基因轉殖
1.了解實驗課題對目的蛋白的要求，包括：目的蛋白分子量有多大，表達目的（是蛋白結
晶、藥劑結合還是製備抗體，不同目的對蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞內表達還是分泌表達，是組成型表達還是誘導型表達；另外，還要了解蛋白表達後需要採用什麼樣的方式進行純化，純化標籤有多大，蛋白純化後是否需要將標籤去除（即標籤的存在是否會影響蛋白的活性）。
還要對目的蛋白進行稀有密碼子（僅限於真核生物基因通過原核表達系統表達時參考，注意稀有密碼子的多少，位置5位或3位，稀有密碼子是否成串出現等）和可溶性網上**等。
稀有密碼子****：
class="txt"> class="txt"> class="txt"> class="txt">原核表達蛋白可溶性****：
class="txt">綜合以上，選取合適的表達載體及宿主菌（做原核表達前對各種載體及宿主菌的充分了解是必須的，建議首先應閱讀《默克原核表達寶典》）。
注意：不是所有的標籤都是用來純化蛋白的，有的標籤有促進蛋白溶解的作用，有的則是二硫鍵形成或利於表達後蛋白的檢測。
一般我們最常用的是胞內誘導型表達（即蛋白翻譯後是存在於細胞內，通過加誘導物的方法來控制表達水平）。
2.搜尋要表達的目的基因的序列，根據其編碼區序列來設計引物；
注意：要注意在引物上加入限制性內切酶識別位點（首先應分析蛋白編碼區內是否含有相同的內切酶識別位點），並通過查閱資料看兩種酶（上下游引物分別加入酶切位點）是否可以在同一反應體系中起作用，並注意標籤序列是在n端還是在c端，若要在c 端保留標籤，則需要將下游引物的終止密碼子替換掉；若要在引物上引入標籤序列，則引物上應加入標籤序列鹼基（即在上游引物或下游引物處引入his的密碼子）；另外，還要注意引物不能造成蛋白的編碼框發生改變；
1，2步的分析至關重要，只有在完成前兩步的工作後才可以進行後續的實驗操作。3.搖菌，進行rna抽提（注意選取不同表現型的菌株），搖菌的時間一定不要太長，太長
的話rna活性不高；
4.mrna反轉成cdna（此步應在第三步完成後立即操作，rna存放時間長易降解）；
5.以cdna為模板，利於設計好的引物進行pcr擴增；
6.通過膠**試劑盒**目的dn**段。
蛋白質表達載體構建步驟08.4.20（08.11.10日修改）
微管蛋白的可溶性表達及純化（08.11.4日修改）
1.將重組質粒（bl21-2β2或rossatta-2β2）的表達菌37℃搖培過夜後，1：20
擴配（約需1h15m）；
2.至od600=0.5~0.7時（約1h15min~1h45min），在15-（0.5-24，0.8-12）；20-
（0.5-12，0.8-8）；28、25-（0.8-8）進行蛋白誘導表達，具體條件根據搖床使用情況而定；
3.對誘導後的菌液4℃，4000g，20min，徹底去上清；離心前取2ml以備用於
總蛋白電泳分析s1；
4.細菌沉澱用bindingbuffer （無尿素，20mm咪唑）懸浮，100ml用5～10ml
緩衝液（約當2~5ml每克菌量），視懸浮後的菌液濃度而定；
5.反覆凍融法破碎細胞：做到14步時由於時間原因不能立即繼續後面的操作，
可將菌懸液放於－70℃冰箱中冷凍；也可用反覆凍融的方法來破碎細胞，在－70℃凍融，在室溫下溶解，反覆凍融3～4次；
6.加lysozyme至1mg/ml （1ml加10ul），在冰上孵育30min～1h；
7.200~300w超聲破碎，2s×30次，停頓2s；若菌種較多可以增加破碎次數。
注意超聲破碎時間，不可太長，否則溫度公升高易導致蛋白變性；而時間太短則破碎不徹底，蛋白無法釋放出來；
注意：第7步可選作，若經過凍融及溶菌酶處理後的菌懸液比較澄清，則可不用超聲破碎。
8.4℃，10000rpm 20~30min，取上清；將沉澱用變性的bindingbuffer （8m
尿素）懸浮，然後室溫搖動30min，取40ul進行電泳樣製備s2；
9.4℃，10000rpm 10min，對上清再離心一次，取40ul進行電泳樣製備s3；
10.上清通過0.45um的細菌過濾器，取40ul進行電泳樣製備s4；
11.用histrap純化：
a)洗柱：用5倍柱床體積（5ml）純水洗柱，避免產生氣泡。
b)平衡：至少5ml bindingbuffer （20mm咪唑），一般10ml，流速在
1ml/min。
c)上樣：流速要慢要，控制在1ml/min，並收集流出的蛋白液，取40ul進
行電泳樣製備s5；
d)重新上樣：對第一次上樣流出的蛋白液再進行過柱一次，取40ul進行電
泳樣製備s6；
e)平衡：用10ml bindingbuffer （20mm咪唑），收集第一管及最後一管，
各取40ul進行電泳樣製備s7，s8。
f)洗脫：用5ml elutionbuffer （500mm咪唑）洗脫，每1ml一管，一般第
一二管中蛋白多。
g)平衡：用5ml的bindingbuffer （20mm咪唑）平衡柱子；
h)封閉：用20％的乙醇封閉柱子，4℃儲存。
若需進行咪唑濃度優化，則純化步驟改為：
10.4 梯度咪唑濃度洗脫：依次用20、30、40、50、75、100、150、200、300、
400、500mm的咪唑進行洗脫，每個濃度各用4ml，收集第2、3v；電泳分析後確定最佳的咪唑平衡及洗脫濃度。
12. 樣品處理：吸取純化後的蛋白液40ul，加入10ul的5×的上樣緩衝液，100℃水浴5min，12,000rpm離心3min後取上清點樣，每個加樣孔15ul。
13. 80v電泳2h左右，取出膠用染色液染色4～5h（**的染色液可過夜），用脫色液脫色3次，觀察拍照。
附：1.總蛋白電泳方法：700ul，12000g離心5min，棄上清，加入50μl 1×蛋白上樣緩
衝液，充分懸浮，煮沸5min，12000g離心5min；
2.構建好的載體在進行蛋白誘導表達前，應選取10個左右的單轉殖進行蛋白誘
導的小量試驗，對誘導後的總蛋白進行電泳分析，選取表達量最大的轉殖儲存（甘油菌，－70℃冰箱）；
3.從－70℃冰箱中活化菌進行蛋白誘導表達試驗時，活化好的表達菌在4℃冰
箱僅可存放15天左右，最多1個月，過期後必須重新劃線活化。4℃冰箱儲存的宿主菌每次用過後必須用封口膜封好。
4.sds-page分析的蛋白樣：總蛋白樣s1，沉澱中的蛋白樣s2，離心後上清中
的蛋白樣s3，過細菌過濾器後的蛋白樣s4，第一次上柱時流出的蛋白樣s5，第二次上柱時流出的蛋白樣s6，20mm bingding buffer過柱後的第一管s7和最後一管蛋白樣s8。
原核表達,SDS PAGE,Western Blot
將轉殖化基因插入合適載體後匯入大腸桿菌用於表達大量蛋白質的方法一般稱為原核表達。這種方法在蛋白純化 定位及功能分析等方面都有應用。大腸桿菌用於表達重組蛋白有以下特點 易於生長和控制 用於細菌培養的材料不及哺乳動物細胞系統的材料昂貴 有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質粒可供選擇。但是，...
真核與原核轉錄的區別
真核生物與原核生物轉錄與複製的區別 真核生物dna的複製基本上與原核生物相同，但比原核生物相同，但比原核要複雜。主要有以下幾方面的不同 1 真核生物dna的合成只是在細胞週期的s期進行，而原核生物則在整個細胞生長過程中都可進行dna合成 2 原核生物dna的複製是單起點的，而真核生物染色體的複製則為...
真核生物與原核生物轉錄與複製的區別
肽鏈的延伸 沒有區別 肽鏈的終止 原核含有三種釋放因子rf1,rf2,rf3。真核只有erf1和erf3。蛋白質前體的加工蛋白質的摺疊蛋白質的合成抑制這三步過程過於複雜，因具體物種而異 相同點真核生物和原核生物複製的相同點 dna複製 都是半保留複製 半不連續複製 雙向複製，在複製中需要的原料 模板...