將轉殖化基因插入合適載體後匯入大腸桿菌用於表達大量蛋白質的方法一般稱為原核表達。這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應用。大腸桿菌用於表達重組蛋白有以下特點：
易於生長和控制；用於細菌培養的材料不及哺乳動物細胞系統的材料昂貴；有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質粒可供選擇。但是，在大腸桿菌中表達的蛋白由於缺少修飾和醣基化、磷酸化等翻譯後加工，常形成包涵體而影響表達蛋白的生物學活性及構象。
表達載體在基因工程中具有十分重要的作用，原核表達載體通常為質粒，典型的表達載體應具有以下幾種元件：
（1） 選擇標誌的編碼序列；
（2） 可控轉錄的啟動子；
（3） 轉錄調控序列(轉錄終止子，核醣體結合位點)；
（4） 乙個多限制酶切位點接頭；
（5） 宿主體內自主複製的序列。
原核表達一般程式如下： 獲得目的基因－準備表達載體－將目的基因插入表達載體中（測序驗證）－轉化表達宿主菌－誘導靶蛋白的表達－表達蛋白的分析－擴增、純化、進一步檢測
一、試劑準備
1、 lb培養基。
2、 100mm iptg（異丙基硫代-β-d-半乳糖苷）：2.38g iptg溶於100ml ddh2o中,0.22μm濾膜抽濾，-20℃儲存。
二、操作步驟
（一）獲得目的基因
1、 通過pcr方法：以含目的基因的轉殖質粒為模板，按基因序列設計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），pcr迴圈獲得所需基因片段。
2、 通過rt-pcr方法：用trizol法從細胞或組織中提取總rna，以mrna為模板，逆轉錄形成cdna第一鏈，以逆轉錄產物為模板進行pcr迴圈獲得產物。
（二）構建重組表達載體
1、 載體酶切：將表達質粒用限制性內切酶（同引物的酶切位點）進行雙酶切，酶切產物行瓊脂糖電泳後，用膠**kit或凍融法**載體大片段。
2、 pcr產物雙酶切後**，在t4dna連線酶作用下連線入載體。
（三） 獲得含重組表達質粒的表達菌種
1、 將連線產物轉化大腸桿菌dh5α，根據重組載體的標誌（抗amp或藍白斑）作篩選，挑取單斑，鹼裂解法小量抽提質粒，雙酶切初步鑑定。
2、 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應篩選更多轉殖，重複亞轉殖或亞轉殖至不同酶切位點。
3、 以此重組質粒dna轉化表達宿主菌的感受態細胞。
（四）誘導表達
1、 挑取含重組質粒的菌體單斑至2ml lb（含amp50μg/ml）中37℃過夜培養。
2、 按1∶50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mllb培養基的300ml培養瓶中, 37℃**培養至od600≌0.4-1.0（最好0.6，大約需3hr）。
3、 取部分液體作為未誘導的對照組,餘下的加入iptg誘導劑至終濃度0.4mm作為實驗組,兩組繼續37℃**培養3hr。
4、 分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收穫沉澱，用100μl 1%sds重懸，混勻, 70℃10min。
5、 離心12000g×1min，取上清作為樣品,可做sds-page等分析。
三 、注意事項
1、 選擇表達載體時，要根據所表達蛋白的最終應用考慮。如為方便純化，可選擇融合表達；如為獲得天然蛋白，可選擇非融合表達。
2、 融合表達時在選擇外源dna同載體分子連線反應時，對轉錄和轉譯過程中密碼結構的閱讀不能發生干擾。
一、原理
細菌體中含有大量蛋白質，具有不同的電荷和分子量。強陰離子去汙劑sds與某一還原劑並用，通過加熱使蛋白質解離，大量的sds結合蛋白質，使其帶相同密度的負電荷，在聚丙烯醯胺凝膠電泳（page）上，不同蛋白質的遷移率僅取決於分子量。採用考馬斯亮蘭快速染色，可及時觀察電泳分離效果。
因而根據預計表達蛋白的分子量，可篩選陽性表達的重組體。
二、試劑準備
1、 30%儲備膠溶液：丙烯醯胺（acr）29.0g，亞甲雙丙烯醯胺（bis）1.0g，混勻後加ddh2o，37oc溶解,定容至100ml, 棕色瓶存於室溫。
2、 1.5m tris-hcl(ph 8.0)：tris 18.17g加ddh2o溶解, 濃鹽酸調ph至8.0,定容至100ml。
3、 1m tris-hcl(ph 6.8)：tris 12.11 g加ddh2o溶解, 濃鹽酸調ph至6.8,定容至100ml。
4、 10% sds：電泳級sds 10.0 g加ddh2o 68℃助溶,濃鹽酸調至ph 7.2,定容至100ml。
5、 10電泳緩衝液(ph 8.3)：tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% sds 10ml加ddh2o溶解, 定容至100ml。
6、 10%過硫酸銨（ap）： 1gap加ddh2o至10ml。
7、 2sds電泳上樣緩衝液：1m tris-hcl (ph 6.8)2.
5ml，-巰基乙醇1.0ml，sds 0.6 g，甘油 2.
0ml，0.1%溴酚蘭 1.0ml，ddh2o 3.
5ml。
8、 考馬斯亮蘭染色液：考馬斯亮蘭 0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddh2o 225ml。
9、 脫色液:甲醇、冰醋酸、ddh2o以3∶1∶6配製而成。
二、操作步驟
採用垂直式電泳槽裝置
（一）聚丙烯醯胺凝膠的配製
1、 分離膠(10%)的配製:
ddh2o4.0ml
30%儲備膠3.3ml
1.5m tris-hcl2.5ml
10% sds0.1ml
10% ap0.1ml
取1ml上述混合液,加temed(n,n,n』,n』-四甲基乙二胺)10μl封底,餘加temed 4μl ,混勻後灌入玻璃板間，以水封頂，注意使液面平。（凝膠完全聚合需30-60min）
2、 積層膠（4%）的配製：
ddh2o1.4 ml
30%儲備膠0.33 ml
1m tris-hcl0.25 ml
10%sds0.02 ml
10%ap0.02 ml
temed2 μl
將分離膠上的水倒去,加入上述混合液,立即將梳子插入玻璃板間，完全聚合需15-30min。
（二）樣品處理: 將樣品加入等量的2×sds上樣緩衝液，100℃加熱3-5min，離心12000g×1min，取上清作sds-page分析，同時將sds低分子量蛋白標準品作平行處理。
（三）上樣: 取10μl誘導與未誘導的處理後的樣品加入樣品池中,並加入20μl低分子量蛋白標準品作對照。
（三）電泳: 在電泳槽中加入1電泳緩衝液，連線電源，負極在上，正極在下，電泳時，積層膠電壓60v,分離膠電壓100v,電泳至溴酚蘭行至電泳槽下端停止（約需3hr）。
（四）染色: 將膠從玻璃板中取出，考馬斯亮蘭染色液染色，室溫4-6hr。
（五）脫色: 將膠從染色液中取出,放入脫色液中,多次脫色至蛋白帶清晰。
（六）凝膠攝像和儲存： 在影象處理系統下將脫色好的凝膠攝像，結果存於軟盤中，凝膠可儲存於雙蒸水中或7%乙酸溶液中。
三、注意事項
1、 實驗組與對照組所加總蛋白含量要相等。
2、 為達到較好的凝膠聚合效果，緩衝液的ph值要準確，10%ap在一周內使用。室溫較低時，temed的量可加倍。
3、 未聚合的丙烯醯胺和亞甲雙丙烯醯胺具有神經毒性，可通過**和呼吸道吸收，應注意防護。
western免疫印跡（western blot）是將蛋白質轉移到膜上，然後利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。
一、原理
與southern或northern雜交方法類似，但western blot採用的是聚丙烯醯胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，「探針」是抗體，「顯色」用標記的二抗。經過page分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽型別及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。
該技術也廣泛應用於檢測蛋白水平的表達。
二、試劑準備
1、 sds-page試劑:見電泳實驗。
2、 勻漿緩衝液：1.0m tris-hcl(ph 6.8) 6.0ml；β-巰基乙醇 0.2ml；ddh2o 2.8ml。
3、 轉膜緩衝液：甘氨酸 2.9g；tris 5.8g；sds 0.37g；甲醇200ml；加ddh2o定容至1000ml。
4、 0.01m pbs(ph7.4)：
nacl 8.0g；kcl 0.2g；na2hpo4 1.
44g；kh2po4 0.24g；加ddh2o至1000ml。
5、 膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddh2o118 ml。
包被液（5%脫脂奶粉，現配）：脫脂奶粉1.0g 溶於20ml的0.
01m pbs中。
6、 顯色液：dab 6.0mg；0.01m pbs 10.0ml；硫酸鎳胺 0.1ml；h202 1.0μl。
三、操作步驟
（一）蛋白質樣品獲得： 細菌誘導表達後，可通過電泳上樣緩衝液直接裂解細胞，真核細胞加勻漿緩衝液，機械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。
然後4℃，13,000g離心15min。取上清液作為樣品。
（二）電泳： 製備電泳凝膠，進行sds-page。
（三）轉移： （半乾式轉移）
1、電泳結束後將膠條割至合適大小，用轉膜緩衝液平衡，5min×3次。
2、膜處理： 預先裁好與膠條同樣大小的濾紙和nc膜，浸入轉膜緩衝液中10min。
3、轉膜： 轉膜裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、nc膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、nc膜精確對齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，將碳板上多餘的液體吸乾。接通電源,恆流1ma/cm2，轉移1.
5hr。轉移結束後，斷開電源將膜取出,割取待測膜條做免疫印跡。將有蛋白標準的條帶染色，放入膜染色液中50s後，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然後用雙蒸水洗，風乾夾於兩層濾紙中儲存，留與顯色結果作對比。
（四）免疫反應：
1、 用0.01m pbs洗膜，5min ×3次。
2、 加入包被液，平穩搖動，室溫2hr。
3、 棄包被液，用0.01m pbs洗膜，5min×3次。
4、 加入一抗（按合適稀釋比例用0.01m pbs稀釋，液體必須覆蓋膜的全部），4℃ 放置12hr以上。陰性對照，以1%bsa取代一抗，其餘步驟與實驗組相同。
5. 棄一抗和1%bsa，用0.01m pbs分別洗膜，5min×4次。
6、 加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗（按合適稀釋比例用0.01m pbs稀釋），平穩搖動，室溫2hr。
7、 棄二抗，用0.01m pbs洗膜，5min×4次。
8、 加入顯色液，避光顯色至出現條帶時放入雙蒸水中終止反應。
四、注意事項
1、 一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經過預實驗確定最佳條件。
2、 顯色液必須新鮮配置使用，最後加入h2o2。
3、 dab有致癌的潛在可能，操作時要小心仔細。
.gst融合表達的有關問題
後面的其實就是乙個逐級放大的過程，2種方法沒有大的差別。
通常在實驗室階段，我們用如下流程：
1.表達載體轉化大腸桿菌，抗性平板培養過夜；
2.挑取單菌落儲存菌種（斜面），同時接種相應抗性lb，**質粒，經鑑定後，將此菌種作為研究菌種。
3.將菌種接種10ml抗性lb，過夜培養。
4.然後，按0.2%-2%接種量接種50ml抗性lb，培養3h左右，od600達0.6-1.0，加入一定濃度的iptg誘導表達3-5h，誘導溫度和時間根據情況而定。
5.冰浴後，洗滌，超聲波破碎。
原核表達總結
原核表達之目的基因轉殖 1.了解實驗課題對目的蛋白的要求，包括 目的蛋白分子量有多大，表達目的 是蛋白結 晶 藥劑結合還是製備抗體，不同目的對蛋白要求不同 是否要其可溶 是胞內表達還是分泌表達，是組成型表達還是誘導型表達 另外，還要了解蛋白表達後需要採用什麼樣的方式進行純化，純化標籤有多大，蛋白純化...
真核與原核轉錄的區別
真核生物與原核生物轉錄與複製的區別 真核生物dna的複製基本上與原核生物相同，但比原核生物相同，但比原核要複雜。主要有以下幾方面的不同 1 真核生物dna的合成只是在細胞週期的s期進行，而原核生物則在整個細胞生長過程中都可進行dna合成 2 原核生物dna的複製是單起點的，而真核生物染色體的複製則為...
真核生物與原核生物轉錄與複製的區別
肽鏈的延伸 沒有區別 肽鏈的終止 原核含有三種釋放因子rf1,rf2,rf3。真核只有erf1和erf3。蛋白質前體的加工蛋白質的摺疊蛋白質的合成抑制這三步過程過於複雜，因具體物種而異 相同點真核生物和原核生物複製的相同點 dna複製 都是半保留複製 半不連續複製 雙向複製，在複製中需要的原料 模板...