一、概述
（一）定義與目的
蠶用消毒劑藥效評價試驗技術指導原則是為蠶用消毒劑進行臨床試驗制定的。蠶用消毒劑臨床消毒效果評價以家蠶為主要物件，其目的是為了評價一種蠶用消毒劑是否對家蠶病原微生物具有消毒（殺滅）作用，並確定臨床應用的推薦用法與用量。廣譜蠶用消毒劑必須對本指導原則中列出的所有菌、毒種進行消毒試驗，專用消毒劑可選擇1種或幾種菌、毒種進行試驗。
（二）適用範圍
本指導原則適用於蠶室蠶具消毒劑、蠶用煙燻劑和桑葉葉面消毒劑對各種病原體的消毒效果評價。
二、試驗設計
（一）試驗用蠶
1.品種：用一化性或二化性的現行普通四眠蠶品種，所用蠶種為雜交種。
2.**：有生產許可證單位生產的合格蠶種。
（二）試驗材料
1.受試藥物及**：受試藥物應與擬上市的製劑完全一致，有完整的產品質量標準，有合乎規定格式的說明書。
受試藥物應**於同一批號，由申報單位自行研製並在gmp驗收合格的車間生產的樣品，並提供中國獸醫藥品監察所或農業部認定的其他獸藥檢驗機構出具的產品檢驗合格報告。
2.標準培養基：下列標準培養基和稀釋液用於試驗菌、毒種的製備。
營養肉湯培養基、營養瓊脂培養基、稀釋液（胰蛋白腖生理鹽水溶液）、沙堡液體培養基、沙堡瓊脂培養基、有機干擾物（3%牛血清白蛋白）。
上述培養基配方參見附錄a。
3.試驗菌、毒種
應採用大學或省級以上專業研究機構鑑定保藏的菌種。
如果採用自然感染病例分離的菌株，應詳細記錄其**，並應經有資質的部門鑑定方可用於試驗。
試驗菌、毒種的製備、計數、保藏及試驗菌片的製備等見附錄b。
（三）殘留消毒劑的去除和中和劑選擇
觀察藥物的殺菌（消毒）作用時，必須在藥物與菌體接觸一定時間後立即去除菌體周圍的藥物或消除藥物的殺菌作用。去除殘留消毒劑的方法可用化學中和法和離心沉澱法等。
1.化學中和法
是目前最常用的一種方法。做法是向標本**液中加入適當量的中和劑，使消毒劑濃度得到稀釋，並且消毒作用受到化學中和。
中和劑選擇試驗方法見附錄c。
2.離心沉澱法
將消毒處理後的標本用磷酸鹽緩衝液反覆離心洗滌3次，最後將沉澱物轉種到合適培養基上進行培養。
無論用何種方法，事先必須用實驗證明該法可中止消毒劑的作用且對實驗菌、毒種無抑制作用，對培養基無不良影響。
（四）試驗分組
進行蠶用消毒劑試驗時應分以下各組。
1.空白對照（不感染不處理）組。
2.感染不處理組（陰性對照組）：根據各種試驗的規定，用稀釋液代替消毒劑溶液，按試驗組同樣的方法進行試驗。所得結果代表菌液原有濃度，以其作為計算殺滅對數或滅活率的初始濃度。
3.試驗組：根據本原則中所列試驗菌、毒種，選定所有的試驗菌種和不同消毒劑濃度以及作用時間進行試驗；如試驗目的是研製專用的蠶用消毒劑，根據本原則中所列試驗菌、毒種，選定相應的試驗菌、毒種和不同消毒劑濃度以及作用時間進行試驗。
4.藥物對照組（陽性對照組）。
每個組設3個重複，每個重複（單元）用50條2齡起蠶。
（五）試驗方法
蠶用消毒劑進行消毒試驗時，常用的試驗方法有：懸液定量殺滅試驗、載體浸泡定量殺滅試驗、載體噴霧定量殺滅試驗和煙燻定量殺滅試驗等。進行蠶室蠶具消毒劑研製時，一般採用懸液定量殺滅試驗或載體浸泡定量殺滅試驗；或追加載體噴霧定量殺滅試驗；進行煙燻劑研製時，採用煙燻定量殺滅試驗。
1.細菌芽孢消毒試驗
進行細菌芽孢消毒試驗時，有下列4種方法可供選擇，按測試目的選擇1種方法進行試驗。
（1）懸液定量殺滅試驗操作程式
消毒液配製：首先按試驗設計或產品說明書要求配製消毒液。無特殊說明者，一律使用無菌硬水配製，配製的濃度為待測濃度的1.
25倍（例如要評價的消毒液濃度為200 mg/l，則應配製250mg/l），置20℃±1℃ 水浴備用。
試驗菌液配製：按照「附錄b 試驗菌、毒種的製備、計數、保藏及試驗菌片的製備」規定的方法配製實驗用菌懸液，濃度為1×108cfu/ml～5×108cfu/ml。
消毒處理：取消毒試驗用無菌大試管，先加入0.5ml試驗用菌懸液，再加入0.
5ml有機干擾物，混勻，置 20℃±1℃ 水浴中 5min後，用無菌吸管吸取上述濃度消毒液 4.0 ml 注入其中，迅速混勻並立即記時。
中和：待試驗菌與消毒劑相互作用至各預定時間，分別吸取0.5ml試驗菌與消毒劑混合液加於 4.5ml 經滅菌的中和劑中，混勻。
活菌計數：各管試驗菌與消毒劑混合液經加中和劑作用10min 後，分別吸取 1.0ml樣液，按活菌培養計數方法測定存活菌數，每管樣液作兩次活菌計數即可。
如平板上生長的菌落數較多時，可進行系列10倍稀釋後，再進行活菌培養計數。
對照：同時用稀釋液代替消毒液，進行平行試驗，作為感染不處理組（陰性對照組）。以不作任何處理的作為空白對照組。
培養與觀察：所有試驗樣本均在 37℃ 溫箱中培養，培養 72h 觀察最終結果。
重複與計量：試驗重複3次，計算各組的活菌濃度（cfu/ml），並換算為對數值（n），然後按下式計算殺滅對數值:
殺滅對數值（kl）＝對照組平均活菌濃度的對數值（no）－試驗組活菌濃度對數值（nx）
計算殺滅對數值時，取小數點後兩位值，可以進行數字修約。如果消毒試驗組消毒處理後平均生產菌落數，小於等於1時，其殺滅對數值，即大於等於對照組平均活菌濃度的對數值。
（2）載體浸泡定量殺滅試驗操作程式
消毒處理：取無菌小平皿，標明所注入消毒液的濃度。按每片 5.
0ml 的量，吸取相應濃度的消毒劑溶液注入平皿中。將盛有消毒劑的平皿置 20℃±1℃ 溫箱內 5 min 後，用無菌鑷子分別放入預先製備的菌片 3 片，並使之浸透於消毒液中。
中和與活菌計數：待菌藥相互作用至各預定時間，用無菌鑷子將菌片取出分別移入一含 5.0ml 中和劑試管中。
用電動混合器混合20s，或將試管在手掌上振敲 80 次，使菌片上的細菌被洗脫進入中和液中，再放置5 min以上，使中和作用充分。最終進一步混勻後，吸取 1.0 ml 直接接種平皿，每管作兩次活菌計數，測定存活菌數。
對照：另取無菌小平皿，按每片5.0ml 的量，吸取相應的稀釋液注入平皿中，置 20℃±1℃ 溫箱內5min 後，用無菌鑷子分別放入預先製備的菌片 3 片，並使之浸透於稀釋液中，進行平行試驗，作為感染不處理組（陰性對照組）。
以不作任何處理的作為空白對照組。
培養與觀察：所有試驗樣本均在 37℃ 溫箱中培養，培養 72h 觀察最終結果。
重複與計量：試驗重複 3 次 （包括對照），計算各組的活菌量（cfu/片），並換算為對數值（n），然後按「懸液定量殺滅試驗」中的公式計算殺滅對數值。
（3）載體噴霧定量殺滅試驗操作程式
選定消毒劑的濃度與作用時間：根據所試菌種和消毒劑對該菌的殺滅能力，選定1個消毒劑濃度（試驗設計中設定的濃度）和至少3 個不同作用時間進行試驗。
載體設定：試驗時，每種載體菌片各取 3 片，以等邊三角形或三角形陣列，均勻排布於一未沾有任何消毒劑的清潔無菌玻璃板上（如無菌平皿內）。
消毒處理：每批試驗以同一濃度消毒劑溶液對上述排列的菌片進行均勻噴霧。每次噴霧的距離和壓力保持一致，以盡量使噴到菌片上的霧粒大小和數量一致。噴霧量以不使菌片濕透、流液為度。
中和與活菌計數：待試驗菌與消毒劑相互作用至各規定時間，取每種載體菌片 1 片，各放入一含 5.0ml 中和劑的無菌試管中。
將試管用電動混合器混合20s，或在手掌上振敲 80 次，使菌片上細菌被洗脫進入中和液中。吸取 1.0ml 上述洗脫液，按活菌培養計數方法測定存活菌數，每管作兩次活菌計數。
每批試驗均應換一塊未沾有任何消毒劑的清潔無菌玻璃板。噴霧器換裝新濃度消毒劑前，應將原殘留消毒劑洗淨，再換裝新濃度消毒劑。
對照：用稀釋液代替消毒液，按同樣的噴霧方法進行處理，進行平行試驗，作為感染不處理組（陰性對照組）。以不作任何處理的作為空白對照組。
培養與觀察：所有試驗樣本均在 37℃ 溫箱中培養，培養 72h 觀察最終結果。
重複與計量：試驗重複 3 次，計算各組的活菌數（cfu/片），並換算為對數值（n），然後按「懸液定量殺滅試驗」中的公式計算殺滅對數值。
（4）煙燻定量殺滅試驗操作程式
根據試驗設計或產品說明書的要求，選定試驗菌種與消毒劑的濃度和作用時間進行試驗。
薰煙容器：煙燻定量殺滅試驗在乙個容積為1m3正方形的密閉箱子內進行，箱子的每個內壁都安裝有寬約20cm的平台，分三層，供消毒時放置菌片用。如需要特定的溫度條件，試驗時箱子內的溫度必須達到要求的溫度。
試驗時，每種載體菌片各取 12片，分上、中、下三層放置，每片菌片放置在一清潔無菌玻璃板上（如無菌平皿內），每層4片菌片，分別放在不同的平台上。
消毒處理：每批試驗根據試驗設計的要求進行，如該產品註明必須利用煙霧進行消毒，要做到消毒時無明火，且藥劑發煙充分徹底。
中和與活菌計數：待試驗菌與消毒劑相互作用至各規定時間，開啟箱子，分別從每層取載體菌片 1 片（共3片），一起放入一含 5.0ml 中和劑的無菌試管中。
將試管用電動混合器混合20s，或在手掌上振敲 80 次，使菌片上細菌被洗脫進入中和液中。吸取 1.0ml 上述洗脫液，按活菌培養計數方法測定存活菌數，每管作兩次活菌計數。
對照：在相同的溫度下將菌片放置在不作消毒處理的箱子內相同時間，進行平行試驗，作為感染不處理組（陰性對照組）。以不作任何處理的作為空白對照組。
培養與觀察：所有試驗樣本均在 37℃ 溫箱中培養，培養 72h 觀察最終結果。
重複與計量：試驗重複 3 次，計算各組的活菌數（cfu/片），並換算為對數值（n），然後按「懸液定量殺滅試驗」中的公式計算殺滅對數值。
（5）評價規定
產品申報新蠶用消毒劑時，要求在產品說明書指定的濃度與3個作用時間，重複試驗3次。在產品指定最低濃度與最短作用時間，以及最短作用時間的1.5倍時，要求懸液定量殺滅試驗中各次的殺滅對數均應≥5.
00。要求載體浸泡定量殺滅試驗、載體噴霧定量殺滅試驗和煙燻定量殺滅試驗中，各次的殺滅對數均應≥3.00，可判定為消毒合格。
在產品指定濃度與最短作用時間的0.5倍時，可容許在部分重複次數中，出現不合格結果。
產品鑑定時，在產品說明書指定的最低濃度與最低作用時間，重複試驗3次。要求懸液定量殺滅試驗中，各次的殺滅對數值均≥5.00，可判定為消毒合格。
要求載體浸泡定量殺滅試驗、載體噴霧定量殺滅試驗和煙燻定量殺滅試驗中，各次的殺滅對數值均≥3.00，可判定消毒合格。
報告中應將各次試驗的結果全部以**的形式列出。感染不處理組（陰性對照組）應列出各次試驗菌濃度，以及平均試驗菌濃度。試驗組應列出殺滅對數值，殺滅對數值大於5.
00時，應表示為≥5.00，而不必列出具體的數字；殺滅對數值小於5.00時，應列出具體的數字（例如2.
58，4.65）。
2023年蠶用消毒劑藥效評價試驗指導原則
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生活飲用水消毒劑和消毒裝置衛生安全評價規範
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