細胞復甦流程

北京****中心實驗室實驗指南

秦偉2013-12-28

目的及應用：

應用於細胞復甦。

試劑及裝置：

dmem細胞培養液，凍存細胞，細胞凍存管，水浴鍋，安全櫃，培養瓶，移液槍，移液管（5ml，10ml），細胞培養箱。

實驗原理：

細胞復甦的原則－快速融化：必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。

實驗步驟：

一. 實驗前準備

１.將水浴鍋預熱至37℃。

２.用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超淨工作台檯面。

３.在超淨工作台中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養瓶。

二．取出凍存管

１.根據細胞凍存記錄按標籤找到所需細胞的編號。

２.從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞.。

三．迅速解凍

１.迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍，並要不斷的搖動，使管中

的液體迅速融化。同時配培養液：向50ml離心管內加入9mldmem細胞培養液

+1ml血清+100ul抗生素。

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２.約1-2min後凍存管內液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超淨台內。向離心管中加入4ml培養液，充分混勻。

四. 平衡離心

配平後，放入離心機中200×g，離心3min。

五.製備細胞懸液：

１.吸棄上清液（先吸出氣泡）。

２.將剩餘的6ml細胞培養液加入到離心後的細胞中，使細胞重懸，充分混勻。

六.細胞計數：細胞濃度以5×105/ml為宜。

七.培養細胞

將符合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶內，培養瓶標明細胞名稱，培養液，實驗人員，實驗時間；將培養瓶放入37℃和5％co2的培養箱內培養。24-48h後換液繼續培養，換液的時間由細胞情況而定。

注意事項：

１.一定要提前開啟水浴鍋，預熱到37℃。

２.離心前忘記平衡，導致離心機損壞和細胞丟失。

３.一次復甦細胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導致細胞交叉汙染。

４.依據凍存細胞相應的培養基種類、血清種類和其它指定的成份和比例，製備培養基。絕大多數的細胞均無法立即適應不同的基礎培養基或不同的血清種類，若因實驗需要，必須有所不同時，務必以緩慢比例漸次改變培養基組成，確定細胞適應後，進行所需之實驗。

５.fbs (fetal bovine serum, 胚牛血清), cs (calf serum, 小牛血清)和hs (horse serum, 馬血清)，對細胞而言差異極大，請務必依據細胞株資料單指定的血清種類培養。６.

取出冷凍管，立即放入37 ℃水槽中快速解凍，水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿，否則易發生汙染。