小鼠肝臟過氧化氫酶的
製備與測定
學院：口腔醫學院
班級：10級口腔本科
指導老師：劉昆
實驗人員：師豔偉 10011040015
李東 10011040021
代鑫鵬 10011040024
邢棟 10011040022
一、實驗背景資料
1. 實驗背景資料
過氧化氫酶(catalase) 是一種廣泛存在於生物體內的氧化還原酶，尤其在動物的肝臟、腎臟、紅細胞中含量較多，其生物學功能是催化細胞內h2o2分解，防止過多h2o2對細胞的危害。人工製備的過氧化氫酶可廣泛應用於食品與乳製品業，造紙與印染業，農業與環保業，以及醫療衛生業等多領域。
小鼠肝臟過氧化氫酶分子量約為238kd，結構上由4個具有相同多肽鏈的亞基組成，是以鐵卟啉為輔基的結合酶，在407nm波長下有特徵性的吸收。溶於水，幾乎不溶於乙醇、氯仿、乙醚等有機試劑，酸性環境下溶解度低易析出，最適溫度為37℃，最適ph值約為7.8。
本實驗以小鼠肝臟為原料，根據過氧化氫酶溶解性和大分子等特性，通過組織勻漿、鹽析、透析、分子篩層析等步驟，提取純化過氧化氫酶，並對製備的過氧化氫酶進行蛋白濃度、分子量、公尺氏常數等測定。
2. 實驗方案
3. 實驗目的
熟悉並掌握生化四大技術—離心、層析、比色、電泳。
熟悉並掌握分離純化小鼠過氧化氫酶和測定其含量的技術和方法。
4. 實驗原理
勻漿原理：
分離純化某一種蛋白質時，首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來並保持原來的天然狀態，不喪失活性，所以要根據所提取蛋白質的性質採用適當的方法將組織和細胞破碎。過氧化氫酶在乙醇、氯仿等有機溶劑中溶解度很小，而脂質在有機溶劑中溶解度較大,通過加入有機溶劑可實現過氧化氫酶與脂質的分離。過氧化氫酶在乙醇、氯仿等有機溶劑中穩定性好，不易變性，而某些雜蛋白在有機溶劑中穩定性差，容易變性。
根據上述原理選擇0.05mol/l，ph4.0醋酸-乙醇緩衝液以及氯仿作為勻漿緩衝液，通過勻漿法破碎肝組織細胞，勻漿液離心後脂質分配到有機相中，部分雜蛋白則沉澱下來，而過氧化氫酶主要存在於上清液中，分離出上清液即獲得過氧化氫酶的粗提液。
鹽析原理：
蛋白質在高濃度鹽溶液中由於水化膜被破壞而溶解度降低。通過向過氧化氫酶粗提液中加入適當濃度的中性鹽,使過氧化氫酶呈鹽析狀態,而部分雜蛋白呈鹽溶狀態，離心後過氧化氫酶主要存在於沉澱中，棄去上清收集沉澱，即可實現過氧化氫酶與部分雜蛋白的分離。
透析原理：
採用20%乙醇、0.1mol/l ph4.7醋酸緩衝液、0.
1mol/l nacl溶液為透析液，對產物進行透析處理。在該透析條件下，過氧化氫酶溶解度變小，以沉澱形式析出，但不變性。透析過夜後離心，過氧化氫酶主要存在於沉澱中，但沉澱中也可能含有少量變性的雜蛋白。
選擇0.1mol/l ph7.8磷酸緩衝液復溶沉澱，則過氧化氫酶溶解，而變性的雜蛋白不能溶解，從而實現過氧化氫酶與部分雜蛋白的分離。
層析原理：
凝膠層析法主要根據混合物中分子大小不同的各種物質，隨流動相流經作為固定相的凝膠層析柱時，各種物質分子擴散移動速度不同使混合物中各種物質得到分離的技術。採用sephadexg-200葡聚醣凝膠層析柱可以實現過氧化氫酶與其他分子量雜蛋白的分離，通過監測洗脫液在407nm（過氧化氫酶特徵性吸收波長）和280nm波長下的光吸收值變化，合併收集od407nm和od280nm重疊峰值管，即可獲得純化後的過氧化氫酶。
lowry法原理：
蛋白質中的酪氨酸等與酚試劑之磷鉬酸、磷鎢酸作用產生藍色化合物，其顏色深淺與蛋白質含量成正比。福林—酚法測定蛋白質可分為兩個步驟：
1.在鹼性溶液中，蛋白質與銅離子發生反應：
蛋白質使試劑中的磷鎢酸-磷鉬酸還原成為藍色化合物，測定光吸收值就可以推算出蛋白質的含量。試劑中的碳酸鈉有緩衝作用，使溶液的ph保持在10左右，顯色最深。福林-酚法靈敏度高、蛋白質濃度測定範圍是25～250μg/ml。
但此法實際上是蛋白質中酪氨酸和色氨酸等與試劑的反應，因此它受蛋白質氨基酸組成的影響，即不同蛋白質中氨基酸組成的不同會使顯色強度有所差別；此外，樣品中酚類及檸檬酸的干擾會使結果偏高。低濃度的尿素（約0.5%左右）、胍（0.
5%左右）、硫酸鈉（1%）、硝酸鈉（1%）、三氯醋酸（0.5%）、乙醇（5%）、丙酮（0.5%）對顯色無影響，上述物質濃度高時必須做校正曲線。
sds聚丙烯醯胺凝膠電泳法原理：
sds聚丙烯醯胺凝膠電泳法是在聚丙烯醯胺凝膠系統中加入陰離子去汙劑十二烷基磺酸鈉，則蛋白質分子電泳的遷移率主要取決於它的相對分子質量（mr），而與所帶電荷和形狀無關。在一定條件下，蛋白質的相對分子量（mr）與電泳遷移率間的關係，可用下式表示：
式中：mr為蛋白質的相對分子量；k，k1為常數，b為斜率；m為遷移率。因此，要測定某個蛋白質的mr，只需比較它和一系列已知mr的蛋白質在sds-凝膠電泳時的遷移率就可以了。
過氧化氫酶公尺氏常數測定原理：
在酸性環境中（硫酸）紫紅色→滴定終點為微紅色，記錄滴定用的ml數，取平均值，計算h2o2準確的摩爾濃度。求出反應前後h2o2的濃度差及反應的速度（v）。以為橫座標，為縱座標作圖可求出h2o2酶的km值。
二、實驗操作
（一）組織勻漿法製備過氧化氫酶粗提液
【器材】
1、動物：成年小鼠
2、器材：手套、鑷子，剪刀，腎盤，冰袋，電子天平，托盤天平，組織搗碎機，10ml勻漿管，冰浴盒，吸量管，滴管，10ml、50ml量筒，100ml燒杯，50ml錐形瓶，玻璃棒，離心管，離心機，製冰機，4℃冰箱，紗布，濾紙
3、試劑：0.05mol/l醋酸-乙醇（23.5％）緩衝液，ph4.0；氯仿
【方法】
1、頸椎脫臼法處死小鼠（6只），取肝臟（按6g計算，不稱重）；
2、加入肝重8.5倍體積（51ml）的預冷勻漿緩衝液（0.05mol/l, ph4.
0醋酸緩衝液,23.5％乙醇，），用組織搗碎機勻漿1-3min（三組合並一塊勻漿，快慢交替使用）。【留樣】不離心，取200ul勻漿液留樣，放-20oc儲存。
3、冰浴下緩慢滴加肝重0.5倍體積（3ml）的氯仿（邊加邊攪拌），再次勻漿30s-1min；勻漿液離心，4℃，7500rpm，30min後，棄沉澱，收穫上清液約44ml於100ml錐形瓶中。
4、取勻漿後上清液120ul，加入40 ul 4×電泳上樣buffer，沸水浴3-5分鐘，備用於sds-page檢測，-20℃冰箱儲存。【留樣】另取200 ul勻漿後上清液-20℃冰箱儲存，用於酶活的測定和蛋白定量。
（二）鹽析與透析法初步純化過氧化氫酶
【器材】
1、100ml錐形瓶，冰浴盒，製冰機，jt-1型定時電磁攪拌器，離心管，托盤天平，離心機，透析袋（截留量10kd-20kd，直徑2公分），滴管，50ml量筒，5ml吸量管
2、試劑：0.5mol/lna2so4；0.1mol/l ph7.8磷酸緩衝液；透析液（20%乙醇，0.1mol/l
ph4.7醋酸緩衝液，0.1mol/l nacl），50%甘油。
【方法】
1、冰浴攪拌狀態下，向肝勻漿上清液中緩慢滴加0.06倍體積的0.5m na2so4溶液，繼續冰浴攪拌1h（用玻璃棒手動攪拌）；
2、將鹽析溶液離心（40c，7500rpm，10min）後棄去上清，保留沉澱；
3、用肝重4倍體積（24ml）的磷酸緩衝液（0.1mol/l，ph7.8）溶解沉澱（用手動玻璃勻漿器助溶）15min ，離心（40c 5000rpm , 10min）後，棄去沉澱，保留上清液；
4、【留樣】取鹽析後上清樣品120ul，用40 ul 4×電泳上樣buffer製樣，煮3-5min，備用於sds-page檢測，-20℃冰箱儲存。
5、將透析袋（截留量10-20kd，直徑2公分）置於沸水中煮5min，清洗晾涼後備用（不要撈出來）；
6、將上清液放入透析袋（截留量10-20kd，直徑2公分）內（注意封口要結實），置於透析液（20%乙醇，0.1mol/l ph4.7醋酸緩衝液，0.
1mol/l nacl溶液，上清液的10倍體積）中透析兩周，中途更換一次透析液（讓學生自帶水溶vc瓶）；
7、兩周後，取出透析袋內混濁溶液，離心（40c，7500rpm，10min）後，棄去上清，收集沉澱；
8、用2ml~3ml的磷酸緩衝液（0.1mol/l，ph7.8）溶解沉澱15min（用手動玻璃勻漿器助溶）， 離心（40c，4000rpm，10min）後，棄去沉澱，收穫上清液。
9、【留樣】取上清樣品120ul，用40 ul 4×電泳上樣buffer製樣，沸水浴3-5分鐘，備用於sds-page檢測。放置-20℃冰箱儲存。
10、將透析袋（截留量10-20kd，直徑2公分）置於沸水中煮5min，清洗晾涼後備用；
11、 將收穫的樣品液（三組樣品合併為一組）放入處理後的透析袋中，置於75%的甘油中包埋濃縮2小時，待樣品濃縮至1~1.2ml收樣，放置-20℃冰箱儲存。
（三）凝膠層析法進一步純化純化過氧化氫酶
【器材】
1、玻璃層析柱（直徑1.8cm長45cm）、細乳膠管、夾子、玻璃棉或棉花、細玻璃棒、收集管（試管）、試管架、紫外\可見分光光度計（型號-9100）、錐形瓶、吸量管、滴管。
2、試劑：sephadexg-200，0.1mol/l ph7.8磷酸鹽緩衝液
【方法】
1、凝膠的處理：每組取2.5g sephadexg-200葡聚醣凝膠乾粉（膨脹體積30~40ml/每克乾膠），浸泡於蒸餾水中充分溶脹，傾斜法除去表面懸浮的小顆粒，替換等體積磷酸緩衝液(0.
1mol/l，ph7.8) 繼續浸泡一天 （準備室操作）。
2、裝柱：取層析柱一支，將層析柱出口接上乳膠管，在柱底部填入一薄層玻璃棉或海綿墊，越薄越好。將層析柱垂直夾於鐵架上，層析柱下端的止水夾夾緊，向柱中加入約 5-7cm 高的緩衝液，用細玻璃棒將凝膠顆粒攪成懸液，順玻璃棒緩緩倒入層析柱中。
當凝膠顆粒沉積約2cm高時，開啟止水夾子，使緩衝液緩緩流出，同時繼續倒入凝膠懸液，掌握倒入速度，使其與緩衝液流出速度大體相同，直至凝膠床高度達35cm（柱床體積約60ml）時為止。關閉止水夾子，要求凝膠床要均勻，中間要連續，不得有氣泡或斷紋，表面要平整。如凝膠床表面不平整，可用細玻璃棒輕輕將凝膠床上部顆粒攪起，待其自然下沉，即可使表面平整。
凝膠床表面要保留10cm高的緩衝液。
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