蛋白質針尖的分子生物物理力學研究
分子生物物理學是綜合應用近代物理學理論和技術,從分子水平來闡明生命現象的一門學科.在生物學發展的歷史程序中,每一次突破性的進展都離不開新的物理手段或新技術方法的產生和應用.蛋白質是一切生物生命活動的承擔者。
本文較全面地介紹了該學科在奈米切割膜蛋白、蛋白質的摺疊和展開、蛋白質間的相互作用、生物分子馬達、蛋白質的導電性方面的研究,揭示了分子生物物理力學研究的重要意義。
細胞的主要組成部分(約佔細胞乾重的60%),是生物中最豐富的分子.蛋白質可以執行多種細胞功能例如訊號傳遞、生物分子的傳輸、生物反應的調控和新陳代謝.20種氨基酸通過疏水力、靜電相互作用和氫鍵構成不同序列排布,從而形成了蛋白質獨特的三維結構也叫構象[241,其中的摺疊結構中的原子空間分布決定蛋白質的功能.
機械力可以改變蛋白質分子的構象,這樣的改變又會影響蛋白質一蛋白質和蛋白質一dna的識別、粘合和解開,導致後續生物化學過程的變化.下面主要討論以掃瞄探針顯微鏡spm(包括原子力顯微鏡afm[2]、摩擦力顯微鏡ffm[3〕、磁力顯微鏡(mfm)[4]等),為主的探針技術在蛋白質切割、變形、相互作用及導電性等方面的研究進展.
1奈米切割膜蛋白
afm以其自身的優勢,例如樣品製備簡單、可在多種環境中操作、奈米尺度觀察和操縱等,其應用領域逐漸從最初的物理學、力學、材料學拓展到生物科學領域.,針尖作為分子解剖刀首先被用於dna單分子的成像和切割,後來又被用於間隙連線的分離.間隙連線是動物細胞中通過連線蛋白實現的細胞間連線,由兩層細胞質膜構成.
在間隙連線的連線點處油脂雙層不直接相連,而是由兩個連線蛋白對接形成通道.在afm成像時增加作用在微懸臂上的力,將間隙連線的上層膜揭開,從而可以研究下層膜的結構.同樣的方法還成功用於研究孔蛋白(ompf)和眼晶狀體水通道主體內在蛋白,另外針尖還可以切割蛋白質複合體單分子,例如光系統i複合體,研究膜蛋白和外蛋白之間的分介面情況.
這些例子都表明afm針尖在分子「手術」方面的廣泛用途。[50,5l]
2蛋白質的摺疊和展開
人們最早是通過研究titin蛋白得到力一伸展曲線是鋸齒型的[52],後來研究胞外基質的鍵蛋白得到類似的結論.titin也被稱為ocmlectin,是連線構成橫紋肌(的a一段和i一段的一種巨型蛋白.該蛋白與肌肉的收縮、彈性及細胞核中的染色體凝聚有關.
蛋白質執行機械功能時,其中的蛋白質區域可以展開和再摺疊.例如由於力的作用產生titin蛋白的伸展,從而導致titni中的免疫球蛋白區域ig和纖維連線蛋白區域(fn,其中最常見的是fn一111)展開.ig和fn一m區域都是所謂的盡一三明治結構,廣泛存在於各種蛋白質中[53].
利用afm對蛋白質分子進行展開和再摺疊實驗,研究拉伸力對蛋白質功能的影響.實驗方法與對dna雙螺旋進行拉伸的方法類似,多區域蛋白質分子在微懸臂梁的氮化矽針尖和由壓電調節精確控制的基體之間被拉伸.蛋白質吸附在基體上,當針尖與基體靠近又分離時蛋白質因為吸引力而附著在針尖上.
當針尖與基體的距離增加時,蛋白質伸長而產生回覆力使得懸臂彎曲,乙個區域展開使得蛋白質的自由長度增加,懸臂上的力恢復到零,再次拉伸導致懸臂上又產生回覆力.
3蛋白質間的相互作用
細胞中的蛋白質一蛋白質和蛋白質一dna的識別和相互作用主要由受體一配體的構象匹配和電荷互補決定,以確保像「鎖一鑰匙」樣的勃合特定性.所以受體一配體豁合包的區域性3d幾何形狀對其豁合特性有很大影響,好的構象匹配產生強而持久的豁合態,反之亦然.其根本原因在於豁合作用主要通過大量非共價鍵如氫鍵實現的.
單個氫鍵的作用雖然很弱,但大量氫鍵的集合作用卻是很強大的.因為氫鍵只有短程作用,為了形成大量氫鍵,受體構想與配體構象之間必須具有良好匹配.
afm、saf、光鑷和生物力探針等針尖測量技術的進步使得人們可以定量分析單個分子鍵的奈米機械效能,從而確定蛋白質間力的大小和作用距離,進一步推導蛋白質的結構與其粘合連線的穩定性之間的關係防].為了實現afm對蛋白質之間的受體一配體勃合力的測量,必須對針尖進行功能化修飾,例如粘著抗體或蛋白質受體.目前有兩種比較成熟的技術:
其一是利用化學吸附作用使溶液中的分子覆蓋在針尖上;其二是利用共價鍵禍合將分子直接粘著在針尖上.afm定量測得蛋白質之間的受體一配體勃合力在15、250pn之間[56].marshall等人[57]通過線性增加afm拉伸力來拉伸單個鍵直到鍵斷裂,發現鍵斷裂所需的力取決於載入過程,進而得到鍵壽命.
nevo等人[58]借助afm研究gtpaserna蛋白及其受體蛋白importinβ1之間的相互作用,發現其導致配體一受體複合體的形成.這種複合體分別以高、低拉伸強度兩種能量截然不同的形式存在,並且外力作用可以使複合體向高拉伸強度形式轉化.
.4生物分子馬達
生物分子馬達是一類特殊的蛋白質,主要包括驅動蛋白、阻凝蛋白、動力蛋白、al,p合酶、dna聚合酶和rna聚合酶,在肌肉收縮、細胞**,訊號傳遞和dna複製等許多細胞過程中起到重要作用.
驅動蛋白是被最廣泛研究的生物馬達分子之一,是細胞內大規模自組裝的主要物質.使用典型的單珠光學捕捉機,科學家發現驅動蛋白是通過乙個行走機制沿名為微管的管道運動的,就像乙個走鋼絲者沿一條鋼絲走動一樣[59,60].後來caret:
等人[61]還出乎意料地發現負載荷可以改變驅動蛋白行走的固有方向性,使其向後走,這種向後行進模式是由atp控制的.並且無論前進還是後退驅動蛋白都是在微秒級以每步8nm沿微管行走.人們利用光鑷對dna和rna聚合酶單分子進行研究,表明施加在酶上的力可以影響細胞的dna複製和抄寫.
在核昔三磷酸濃度飽和的情況下施加24、25pn的力,聚合酶會停止作用,基因抄寫速度也隨著施加力的增加而降低[62,63].wdite等人[64]利用光學捕捉機進行單分子實驗,還發現t7dna聚合酶沿其單鏈dna的移動速度受到作用在dna上的拉力影響,從而認為拉力作用下dna的變形可以影響dna一聚合酶的相互作用.
.5蛋白質的導電性
蛋白質電子傳遞的研究不僅對闡述生物能量傳遞具有重要的意義,而且有助於促進生物分子在分子電子器件中的應用.金屬蛋白以其固有的電化學和電學特性在光合作用和呼吸作用中起到重要作用,其中銅藍蛋白具有良好的電化學性質和明確的分子結構,常常作為研究蛋白質電子傳遞的模型分子[65].zhao等人66-68]借助c-afm研究了銅藍蛋白單分子的電荷傳輸特性,得到壓縮力與i一v曲線的關係.
anddolfi等人[69]結合spm與stm探測吸附在金電極上的兩種白楊質體藍素(一種在葉綠體的光合作用中作為電子傳遞體的含銅蛋白)的突變異種:pcss和pcsh的電效能和形貌,並對這兩種金屬蛋白突變異種的效能進行了比較.鐵蛋白是包含在動物、植物、真菌核細胞中的一
類很穩定的儲存離子的蛋白質.由於其特殊的磁性、電化學性質和結構組裝效能,鐵蛋白用作碳奈米管生長的催化劑以及合成磁性、傳導和半導奈米晶體的模板.xu等人[70]借助c一afm對馬脾鐵蛋白進行了導電性測量.
馬脾鐵蛋白由外徑12nm、內徑8nm的脫鐵核鐵蛋白殼及內部填充的全鐵蛋白構成.他們發現全鐵蛋白的傳導率是脫鐵核鐵蛋白的5、15倍,鐵
蛋白的蛋白質殼是電子轉移的隧道能壘.通過殼時的傳導性可能是限制電子轉移的因素所以改變蛋白質殼可能改善電子轉移狀況.
bonniii等人[71]通過自由含硫團將酵母菌的細胞色素c蛋白質分子(ycc)化學吸附在金電極上,,覆蓋au的針尖以接觸模式進行探測,通過i一v曲線得到電阻與。一afm掃瞄力的關係.
分子生物學實驗的部分試劑
衍生緩衝液 由於tris緩衝液為弱鹼性溶液，dna在這樣的溶液中會被去質子化，從而提高其溶解性。用途 tris緩衝液不僅被廣泛用作核酸和蛋白質的溶劑，還有許多重要用途。tris被用於不同ph條件下的蛋白質晶體生長。tris緩衝液的低離子強度特點可用於線蟲 c.elegans 核纖層蛋白 lamin ...
醫學分子生物學教學的幾點體會
摘要 醫學分子生物學是一門發展迅速的新興學科。在醫學分子生物學教學中,我們採取了優化課程設定 開展雙語教學 完善考核體系等策略,提高了學生的理論水平和實踐技能,取得了良好的教學效果。關鍵詞 醫學分子生物學 教 課程設定 分子生物學是研究生物大分子的結構 功能及基因結構 表達與調控的科學,從分子水平 ...
生物化學與分子生物學課程實驗的體會
井岡山大學醫學院口腔10 本1 班張佳 每次實驗課前，老師都要求我們做好每一次實驗課前的理論原理預習,這樣老師可以在盡可能短的時間內說明實驗操作的注意事項,使我們盡快了解和掌握實驗的原理,操作過程,順利地完成實驗操作,以期達到更好的實踐效果。在實驗操作的選擇上,雖然實驗課時有限，老師還是盡可能讓我們...