陳林偉南京中醫藥大學研究生院
關鍵詞: 多醣結構提取分離純化藥理作用現狀與展望
多醣又稱多聚糖(polysaccharide),是一類天然具有多種生理活性的高分子化合物。由於膜的化學功能,免疫物質的化學研究與發展以及新藥物資源的尋找與研究等,一直在藥物有效成分的提取分離過程中作為雜質除去的多醣類,被發現在生物體中的作用不僅是作為能量資源或結構材料,更重要的參與了生命現象中細胞的各種活動[1],具有多種多樣的生物學功能,因此糖的研究開始逐步活躍起來。研究物件包括真菌類、地衣類、植物、花粉,範圍涉及多醣的分離純化、結構分析、理化性質、免疫學、藥理學以及**應用等。
多醣作為生物效應調節劑,主要影響網狀內皮系統、巨噬細胞、淋巴細胞、白細胞以及rna、dna、蛋白質的合成,camp和cgmp的含量、抗體的生成、補體的形成以及干擾素的誘生,還具有抗腫瘤、抗炎、抗凝血、抗病毒、抗放射、降血糖、降血脂等活性[2]。其中,一些分子量在幾千以上,具有很強生物活性的活性多醣的研究受到日益重視,它們的生理活性、化學結構以及構效關係成為多醣研究的前沿陣地,取得了很大的進展[3]。大量的藥理和臨床研究表明,多醣類化合物是一種免疫調節劑,它能啟用免疫細胞,提高機體的免疫功,而對正常細胞沒有毒***,這類多醣沒有細胞毒性而且藥物質量通過化學手段容易控制,已經成為當今新藥的發展方向之[4]。
1多醣的結構分類
多醣的結構分類沿用了對蛋白質和核酸的分析方法,單醣是醣類的組成單元,單醣之間脫水形成糖苷鍵,並以糖苷鍵線性或分枝連線成寡糖和多醣。一般將少於20個醣基的糖鏈稱為寡糖,多於20個醣基的糖鏈稱為多醣。寡糖和多醣的結構也可分為一級、二級、**和四級結構[5]。
1.1一級結構
多醣的一級結構包括醣基的組成、醣基排列順序、相鄰醣基的連線方式、異頭物構型以及醣鏈有無分支、分支的位置與長短等。與蛋白質和核酸相比,糖的一級結構非常複雜。例如,兩種氨基酸只能構成一種二肽,而兩種相同單醣能結合形成11種不同的二糖;另外,通過硫酸化、乙醯化、磷酸化、甲基化等衍生形式還可形成糖衍生物。
最簡單的多醣由相同的單醣殘基以相同的鍵型連線形成線性鏈,比如直鏈澱粉是以麥芽糖作為結構單位的1,4鍵合的d-吡喃葡萄聚醣。
1.2二級結構
多醣的二級結構指多醣骨架鏈間以氫鍵結合所形成的各種聚合體,只關係到多醣分子中主鏈的構象,不涉及側鏈的空間排布[6]。在多醣鏈中,糖環的幾何形狀幾乎是硬性的,各個單醣殘基繞糖苷鍵旋轉而相對定位,可決定多醣的整體構象。通常糖苷鍵有兩個可旋轉的主鏈二面角:
u(h1-c1-o1-c糖配基),w(c1-o1-c糖配基-h糖配基),兩個單醣若為1→6連線,則還有第三個可旋轉的二面角x(o6-c6-c5-o5),解決寡糖構象的關鍵在於確定u、w、x的取值。但是,它們的取值受相鄰糖環之間的空間阻礙和相鄰糖殘基間的非共價鍵相互作用的嚴格限制。因此,多醣的二級結構形式主要依賴一級結構的排步[7]。
1.3**和四級結構
多醣鏈一級結構的重複順序,由於糖單位的羥基、羧基、氨基以及硫酸基之間的非共價相互作用,導致有序的二級結構空間有規則而粗大的構象,即是多醣鏈的**結構[8]。
多醣的四級結構指多聚鏈間非共價鏈結合形成的聚集體。多醣鏈的聚集作用可在相同的
分子間進行(如纖維素鏈間的氫鍵相互作用),也可在不同的多醣鏈間進行(如黃桿菌聚醣的多醣鏈與半乳甘露聚醣骨架中未取代區域之間的相互作用[9]。由上可知,多醣的結構形態是各個單醣殘基在空間相對定位的綜合。解析這些定位,對理解多醣的生物學功能有極深刻的意義。
2多醣的結構分析
2.1結構分析前需進行純度檢測
常用的方法有超離心、高壓電泳、紙色譜、薄層色譜、高效液相色譜、旋光測定、凝膠色譜、高效凝膠滲透色譜(hpgpc) [10]等。其中hpgpc測定多醣的純度和分子量具有快速、高解析度和重現性好的優點,在國內外已得到廣泛應用。
2.2結構分析的方法有物理方法,包括紅外色譜、核磁共振、質譜、氣相色譜、紫外光譜等;化學方法,包括化學降解法(例如酸水解、過碘酸氧化、smith降解、鹼降解、甲基化反應、乙酞解反應)、酶解法、免疫化學和放射化學法 [11],一般需物理和化學方法相結合才能完成多醣的結構測定。
2.2.1甲基化反應[11]用於分析測定複合物的糖苷鍵。
2.2.2質譜
其新的電離方法使分析非揮發性、高極性及大分子量的物質成為可能。化學電離質譜
侷限於寡糖分析。場解析質譜適用分子量在2500範圍內的醣類(先部分甲基化)。二次電離質譜和快原子轟擊質譜的特點是從配醣基的氧裂解產生離子峰,使寡糖結構測定更為容易、快速。
採用部分甲基化後,可分析分子量在3500範圍內的多醣。
2.2.3核磁共振
用於解決多醣結構半糖昔鍵的構型以及重複結構中的單醣數目。1hnmr用於測定簡單的多醣。13cnmr用於測定複雜多醣並可確認各種碳核、分辨分子的構型及構象[12]。
2.2.4氣相色譜和氣相一質譜聯用
通常可迅速、準確地測出多醣的組成及各單醣之間的摩爾比,要求樣品具揮發性,因而常需製備成矽烷化衍生物或乙酞化衍生物。
2.2.5紫外光譜
可用於檢測多醣中是否含有蛋白質、核酸、多膚類等(其吸收峰在260一280nm)。紅外光譜用於確定糖昔鍵構型及官能團。
2.2.6酸水解
它分完全水解與部分水解。完全水解用於鑑別多醣的單醣組分。通常己聚醣的水解條件為1mol·l--1硫酸100℃4h、6h、8h不等或者為三氟醋酸數分鐘、數小時;多醣中含有醣醛酸的需更強烈的水解條件。
若連有阿拉伯吠喃糖則控制水解條件防止發生降解反應。部分酸水解用於解析多醣中的低聚醣,可用酶解法替代。水解後用氫氧化鈉或碳酸鋇等鹼溶液中和,進而用色譜法分析,如gc ,hplc ,tlc等[13]。
3多醣的提取
3.1 熱水浸提法
這種方法是在前述的脫脂脫色處理後，加水煎煮 2 ～ 3 次，每次 1 ～ 3h，通過持續不斷的加熱，使植物細胞壁軟化破裂，使多醣溢位，然後經過過濾即可獲得粗多醣溶液。這種方法的原理是：植物多醣溶於熱水特性，通過這種方法較多地保留多醣，不破壞多醣結構。
其優點是成本低廉、工藝簡單、無需特殊儀器裝置，可用於大規模生產，是最常用的提取多醣的方法。其缺點是工藝提取時間長，還有待改善[14]。
3.2 超聲輔助法
超聲輔助法是一種物理破碎植物細胞壁的方法，主要利用了 20khz 以上聲波的空化效應。超聲波因這種效應形成小氣泡，小氣泡會隨周圍介質的振動而不斷運動、長大或突然破滅。破滅時周圍液體突然衝入氣泡而產生高溫、高壓，同時產生激波，使細胞壁瞬間破碎，植物細胞內的有效成分得以釋放，直接進入溶劑中並充分混合，從而提高提取率[15]。
不足之處是：超聲波還有機械剪下作用，長時間的作用會使大分子的多醣斷裂，影響其生物學活性；且超聲波功率過大時產生熱效應，容器內發生區域性瞬時公升溫現象，也有可能對多醣組分及空間結構造成破壞。
3.3酶輔助法
酶可以溫和地將植物組織破碎分解，使其有效成分釋放。對植物細胞而言，比較常用的酶有纖維素酶、蛋白酶、果膠酶等。蛋白酶用來去除雜蛋白，而纖維素酶和果膠酶則用來破壞細胞壁。
合理有效地利用酶，可以使濃縮工藝和後續的脫蛋白工藝操作變得簡便易行、省時省力，提高粗多醣的提取率和蛋白質脫除率[16]。
3.4微波提取法
微波提取法所提到的微波是頻率介於 300mhz和 300ghz之間的高頻電磁波，它能夠透入植物細
胞內壁。微波透過對微波透明的溶劑，到達物料內部的維管束和細胞內部，轉化成為分子的動能而發熱。連續的高溫使細胞內部壓力超過其空間膨脹的能力，從而導致細胞壁破裂，釋放出細胞內有效成分，進入提取溶劑。
3.5酸提法、鹼提法和醇提法
這類方法是通過酸鹼醇溶液的充分作用，使植物細胞、細胞壁充分吸水脹膨而破裂，從而使胞內多醣充分釋放出來，提高得率，但這些方法只能針對某些多醣，且存在諸多弊端。郝曉敏[17]等採用酸提法，多醣提取率僅為9.54%，苯酚- 硫酸法測得提取物中多醣含量為20.
96%；孟慶勇[18]等採用熱水浸提法粗江蘺多醣的提取率達到 14.98%，多醣含量達到了 78.2%。
楊雲等[19]使用鹼提法進行大棗渣多醣的提取，提取率為30.8%，含量為 54.6%；而使用熱水浸提法[20]，多醣提取率僅為 20%，含量為 43.
54%.田洛[21]等應用醇鹼法提取黃芪多醣，在ph值=12 的 5%碳酸鈉乙醇溶液中多醣提取率高達 19.15%，分別是熱水浸提法和鹼提法的 3.
53 倍和 2.63 倍。
3.6超聲-微波協提法
超聲-微波協提法是在低溫常壓狀態下，將超聲振動和開放式微波兩種作用方式相結合，充分利用超聲振動的空化作用以及微波的高能作用，加速被提取物從固相進入溶劑的過程，克服了常規超聲提取法和微波提取法的不足，具有節省提取時間、提高提取效率等優點。趙小亮等[22]用此種方法提取杜梨多醣的提取率為 13.91%，比採用熱水浸提法提取多醣的提取率高 1.
17%。但該方法最大的不足就是目前市場上的多是超聲-微波協同萃取儀，僅可做實驗室研究用，無法大規模進行生產應用。
4多醣雜質的去除
4.1 蛋白質的去除
研究證實，在採取醇沉澱或其它溶劑進行多醣提取時會含有較多雜質，其中以蛋白質最為常見，因此需要採取有效的措施展開雜質去除操作，現階段常用於去除蛋白質的方法有sevage 法。還有酶法除蛋白：取龍眼、荔枝粗多醣，按 1%比例加入木瓜蛋白酶，防腐保溫48h，按照多醣體積的 20%加入氯仿，再加入氯仿體積 20%的正丁醇，劇烈**，除去水層與溶劑層交界處的軟質彈性變性蛋白[22]。
本組蛋白質去除後得到溶液濃度為 53.24%。
4.1色素的去除
在提取過程中由於氧化作用因此會有色素生成，進而對多醣的色譜分析及性質鑑定產生一定程度的影響。
5 多醣的分離與純化方法
5.1 超濾法
超濾方法對多醣成分進行分離純化時，一般採取中空纖維濾膜對多醣中去除蛋白質後的小分子雜質進行濾過。
5.2沉澱法
目前常用的沉澱法以季銨鹽沉澱法和分解沉澱法最為常用。包括分步沉澱法,在多醣溶液中加入不同濃度乙醇溶液,得多個多醣;鹽析法(常用的鹽析劑有氯化鈉、氯化鉀、硫酸錢等);金屬絡合物法(常用的絡合劑有菲林溶液、氯化銅、氫氧化鋇、醋酸鉛);季錢鹽沉澱法,根據長鏈季錢鹽能與酸性多醣成鹽形成水不溶性多醣化合物的特性分離酸性多醣及中性多醣,如人參莖葉粗多醣經反覆沉澱、透析、離心和脫脂後,以十六烷基澳化錢分級沉澱,每個樣品分別得到酸性糖、弱酸性糖和中性糖部分。
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