實驗一細胞培養的基本技術
一、實驗目的
1、了解細胞培養室的設定、裝置和基本要求。
2、掌握細胞培養用器械的清洗、消毒方法及無菌操作技術。
二、實驗材料
1、實驗裝置：高壓滅菌鍋、電子分析天平、ph計、超淨工作台、濾器、濾幫浦。
2、實驗器材：不同規格毛刷、燒杯、量筒、攪拌棒、瓷缸（陶瓷或玻璃）。
三、實驗步驟
（一）器械的清洗
1、玻璃器皿的清洗（植物細胞培養只需①、②操作即可）：
①清水浸泡：浸泡主要是軟化器皿表面所附著的物質。
②刷洗：將浸泡後的玻璃器皿在洗滌劑中用毛刷反覆刷洗，以除去器皿表面的雜質。烘乾備用。
③浸酸：將經過刷洗和烘乾後的玻璃器皿浸泡在由重鉻酸鉀、濃硫酸配置而成的清潔液中，利用強氧化作用清除瓶皿表面可能殘留的有機物。浸泡時間要在6小時以上，最好過夜（用於動物細胞培養）。
④沖洗：浸酸後的器皿從洗液中取出後，用自來水沖洗10遍以上。再用蒸餾水、三蒸水各清洗3遍以上，取出置於烤箱內（40~50℃）烘乾（用於動物細胞培養）。
2、金屬器械的清洗和消毒：金屬器械不能在清潔液中浸泡，一般用洗滌劑洗刷乾淨後，再用自來水和蒸餾水反覆沖洗乾淨，烘乾。
3、膠塞的清洗和消毒：細胞培養中使用的膠塞不能用清潔液浸泡。清洗過程中，要先在水中浸泡，然後2%naoh溶液煮沸10分鐘。
自來水沖洗晾乾後，再用1%的稀鹽酸浸泡30分鐘，最後再用自來水、蒸餾水、三蒸水進行常規清洗，烘乾備用。注意使用後的膠塞應及時浸泡在清水中。
4、塑料物品的清洗：塑料物品用後立即用流水沖淨或浸入清水中，防止乾涸。一般不用刷洗以防劃痕和損傷。
清洗乾淨的器皿先在2%naoh溶液浸泡過夜，自來水沖洗晾乾後，再用1%的稀鹽酸浸泡30分鐘。最後再用自來水、蒸餾水、三蒸水進行常規清洗，烘乾備用。
注：清潔液的配製（盛裝於瓷缸中，用於動物細胞培養時玻璃器皿的清潔）
（二）器械的消毒滅菌
造成細胞培養失敗的主要原因是發生汙染，特別是微生物的汙染，因此對細胞培養中所用的器械進行消毒滅菌是非常重要的。最常用的物理消毒方法有如下幾種：
1、紫外線消毒：紫外線是一種低能量的電磁輻射，可以殺滅多種微生物。目前，多用紫外燈直接照射培養室內空氣、地面、工作台表面等進行消毒。
2、高溫乾熱滅菌：一般在烤箱中進行，主要用於消毒玻璃器皿。乾熱滅菌後的器皿乾燥，易於存放。
但是，幹熱傳導慢，可有冷空氣存留於烤箱內，需要較高的溫度和較長的時間才能達到消毒的目的，因此需加溫到160℃，保持90-120℃分鐘。消毒後不可馬上將烘箱門開啟，以免冷空氣進入，影響消毒效果和損壞玻璃器皿或發生意外。
3、壓力蒸汽滅菌：一般使用高壓蒸汽滅菌鍋進行。為保證消毒的效果，待消毒的物品不應裝得太滿，以便消毒器內空氣流通。
在加熱公升壓之前，開啟排氣閥門，以使加熱後消毒器內的冷空氣排出。冷空氣排完後，關閉排氣閥門，開始公升壓，待達到所需壓力後，開始計時，一般為100kpa、121℃下滅菌15~20分鐘。消毒完畢後，不要立刻開啟蓋子，應先等壓力自行下降到一定程度後，開啟排氣閥，放氣後，再開啟消毒器的蓋，將物品取出，放入烤箱內烘乾。
4、過濾除菌：是將液體或氣體用具有微孔的薄膜過濾，使大於孔徑的細菌等微生物顆粒阻留，從而達到除菌的目的。目前，多數實驗室採用微孔濾膜濾器除菌，濾膜孔徑為0.
22~0.45μm。
（三）培養材料的消毒滅菌
採自自然界的實驗材料，攜帶微生物及雜質，接種前須進行表面消毒滅菌，對內部已受微生物侵染的材料應予以淘汰。採來的實驗材料先用流水沖洗10~20min或更長時間，然後在一定濃度藥劑中浸泡處理（須在超淨工作台上操作），進行表面消毒滅菌。所用的藥劑種類、濃度、處理時間隨植物種類和取用的器官部位的不同而異，常用消毒劑的滅菌效果見表1-1。
消毒劑對植物組織是有毒的，應正確選擇其濃度和處理時間，減少它對組織的傷害。經過滅菌的材料，需用無菌水清洗4~5次，瀝去水分待用。
表1-1 常用消毒劑消毒滅菌效果比較表
（四）無菌操作室的消毒滅菌
無菌材料進行接種或傳代時，必須從各方面防止任何汙染物進入容器，所以接種區的消毒至關重要。由於接種區的汙染源主要是空氣中的細菌和真菌孢子，因此長期停用後的無菌操作室應進行燻蒸消毒滅菌（常用每立方公尺含2ml甲醛和1g高錳酸鉀的消毒液或6ml/m3乙二醇等加熱燻蒸）。每次接種前都應進行地面衛生清潔，並用紫外燈照射20min，進行空氣的消毒滅菌。
對接種用的超淨工作台，每次接種前用紫外燈照射20min，同時用70~75%酒精擦洗，然後方可進行培養材料的接種。
（五）無菌操作
培養材料接種時的無菌操作過程除上述各項消毒滅菌操作外，還需完成以下無菌操作步驟，從而獲得接種的無菌培養材料。
1、無菌操作前的準備工作：
工作人員無菌操作前需穿好工作服、戴上工作帽和口罩，坐在超淨工作台前，將各種操作所用金屬器械浸泡在盛有95%（或70%）酒精溶液的廣口瓶中，點燃灑精燈，在耐熱器皿（如不鏽鋼小盤或搪瓷盤）中加入少量酒精，將蘸有酒精的金屬器械及器械支架放入耐熱器皿中灼燒，待冷涼後將器械置器械支架上備用，所有操作器械每次使用後都要滅菌；用70%~75%的酒精擦拭新培養容器和繼代培養容器表面，放置超淨工作台上待用；再用同樣濃度的酒精擦拭雙手和前臂，完成無菌操作準備工作。
2、無菌操作步驟：
準備工作完成後，對來自於自然生長條件下的外植體，按前述培養材料的消毒滅菌方法滅菌後取出，放入已消毒滅菌的培養皿中，然後置於超淨工作台酒精燈火焰下方，用滅菌剪刀等器械進行適當分離、切割或其它處理後備用。在酒精燈火焰處將培養容器的瓶塞（蓋）輕輕開啟，瓶口在火焰處旋轉灼燒，用鑷子將培養材料置於培養基上，將鑷子放在酒精瓶中蘸酒精，置於酒精燈火焰上灼燒後放回支架，然後迅速灼燎瓶塞（蓋）數妙後塞回瓶口。對繼代培養材料的無菌操作，需在燈焰處開啟瓶塞（蓋），繼代培養材料為液體培養細胞時直接用滅菌吸管吸取培養細胞液放入新鮮培養基中；繼代材料為固體培養細胞時，用滅菌鑷子挑取適量材料置新鮮培養基上；繼代材料為其它組織時，用滅菌剪刀或其它器械對培養材料進行適當切割後，用滅菌鑷子將其置於新鮮培養基上（中），然後迅速灼燎瓶塞（蓋）數妙後塞回瓶口。
3、汙染源及其表現特徵
當培養材料、轉接器皿、無菌操作環境等消毒滅菌不徹底時，培養材料則攜帶有微生物，當其被轉接到營養豐富的培養基上時，微生物繁殖迅速，出現各種汙染菌斑。微生物生長時分泌出對植物組織有毒的代謝廢物，致使培養材料死亡或失去使用價值。在培養過程中，若培養材料附近出現黏液或混濁的水跡，並有發酵狀泡沫，則是細菌性汙染。
在細菌性汙染中，特別要注意一種呈乳白色的芽孢桿菌，它們出現在培養基表面，或呈滴形雲霧狀存在於培養基內，若出現應嚴格滅菌。而培養基表面出現的黃色、白色、黑色等不同顏色的黴菌，屬真菌性汙染。
此外，需提及與微生物汙染無關的酚類物質汙染，因它也是培養材料常遇到的問題，它是由於組織中的多酚氧化酶被啟用，使細胞中的代謝發生變化，酚類物質被氧化後產生醌類，這類物質呈棕褐色，使培養材料褐變，甚至接種後使培養基變褐，嚴重影響培養物的生長發育。可以利用一些抗氧化劑，如抗壞血酸、半胱氨酸等進行材料的預處理或預培養，或者在培養基中加入抗氧化劑或吸收酚類物質的化合物，如聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，pvp）、活性碳等來減輕醌類物質的毒害。
實驗二動物細胞培養基的配製
一、實驗目的
1、掌握含血清細胞培養液的配製方法。
2、掌握胰蛋白酶溶液的配製方法。
二、實驗材料
1、實驗裝置：電子分析天平、ph計、超淨工作台、濾器、濾幫浦。
2、實驗器材：燒杯、量筒、攪拌棒、血清瓶（分裝培養液用）、0.22μm濾膜。
三、細胞培養液dmem的配製
動物細胞培養使用的培養液一般由合成培養基和新生牛血清配製而成。合成培養基有商品**，即商品培養基或稱乾粉培養基。根據不同的細胞種類，可以選擇不同的合成培養基。
其中最常見最常使用的商品培養基為dmem和rpmi-1640乾粉培養基。本實驗僅以dmem為例，介紹其配製方法。
1、按包裝袋上的說明，將一袋dmem粉劑用新鮮三（次）蒸餾水溶解。
2、按包裝袋上的說明，將一定量的nahco3加入dmem溶液中。
3、加入抗生素，使青黴素鈉的終濃度達到100μg/ml，（硫酸）鏈黴素的終濃度達到100u/ml。
4、調培養液ph至7.0～7.2（此時培養液為鮮紅色，也稱櫻桃紅色）。
5、超淨台內過濾除菌。
6、加入經滅活處理的新生牛血清，其中濃度為10%~20%（根據實際情況，血清可在細胞培養操作時加入）。
7、分裝，-20℃貯存備用（不加滅活血清的培養基可於4℃儲存1個月）。
四、胰蛋白酶溶液的配製
1、d-hanks溶液的配製：準確稱取nacl 8.0g、kcl 0.
4g、na2hpo412h2o 0.716g、kh2po4 0.06g、nahco3 0.
35 g，溶解於三（次）蒸餾水中，調ph至7.0～7.2，定容為1000ml。
高壓滅菌後，於超淨台內加入過濾除菌的青黴素、（硫酸）鏈黴素，使其終濃度分別為100u/ml，100μg/ml。4℃冰箱儲存待用。
2、胰蛋白酶消化液的配製：用d-hanks溶液將胰蛋白酶配成濃度為0.25%的工作液，過濾除菌後，-20℃貯存備用。
實驗三動物細胞的傳代培養及凍存
一、實驗目的
1、 掌握細胞傳代培養的原理及操作方法。
2、掌握細胞凍存的方法。
二、實驗原理
傳代培養是組織培養的常規保種方法之一。也是幾乎所有細胞生物學實驗的基礎。當細胞在培養瓶中培養時，細胞不斷生長增殖。
對於貼壁生長的細胞，單層細胞互相匯合，整個瓶底逐漸被細胞覆蓋。對於懸浮生長的細胞，細胞相互匯集成團。這時需要進行分離培養，否則細胞會因生存空間不足，營養障礙而死亡。
細胞由原培養瓶內分離稀釋後傳到新的培養瓶中的過程稱為傳代（或稱繼代）。傳代可獲得大量細胞供實驗所需。
體外培養的細胞，隨著傳代次數的增加，其各種生物特性會漸漸發生變化。為此，需將培養的細胞及時凍存。直接凍存細胞會導致細胞內外環境形成冰晶，從而使細胞內部發生一系列變化，進而引起細胞死亡。
因此，凍存細胞時常向培養液中加入適量的甘油或dmso(二甲基亞碸)，從而使冰點下降，通過緩慢凍存，避免或減少冰晶的形成。
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