人白細胞介素-25(il-25)酶聯免疫分析
試劑盒使用說明書
廈門慧嘉生物科技****
本試劑僅供研究使用目的:本試劑盒用於測定人血清,血漿及相關液體樣本中白細胞介素25(il-25)的含量。
實驗原理:
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人白細胞介素-25(il-25)水平。用純化的人il-25抗體包被微孔板,製成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入白介素-25(il-25),再與hrp標記的il-25抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體複合物,經過徹底洗滌後加底物tmb顯色。tmb在hrp酶的催化下轉化成藍色,並在酸的作用下轉化成最終的黃色。
顏色的深淺和樣品中的il-25呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(od值),通過標準曲線計算樣品中人白細胞介素-25(il-25)濃度。
試劑盒組成:
樣本處理及要求:
1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清,儲存過程中如出現沉澱,應再次離心。
2. 血漿:應根據標本的要求選擇edta或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘後,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。
仔細收集上清,儲存過程中如有沉澱形成,應該再次離心。
3. 尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清,儲存過程中如有沉澱形成,應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。
離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時,用pbs(ph7.
2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反覆凍融,以使細胞破壞並放出細胞內成份。
離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。儲存過程中如有沉澱形成,應再次離心。
5. 組織標本:切割標本後,稱取重量。
加入一定量的pbs,ph7.4。用液氮迅速冷凍儲存備用。
標本融化後仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的pbs(ph7.4),用手工或勻漿器將標本勻漿充分。
離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。分裝後乙份待檢測,其餘冷凍備用。
6. 標本採集後盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取後應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放於-20℃儲存,但應避免反覆凍融.
7. 不能檢測含nan3的樣品,因nan3抑制辣根過氧化物酶的(hrp)活性。
操作步驟:
1. 標準品的稀釋與加樣:在酶標包被板上設標準品孔10孔,在第
一、第二孔中分別加標準品100μl,然後在第
一、第二孔中加標準品稀釋液50μl,混勻;然後從第一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔,再在第
三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl,混勻;然後在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,再各取50μl分別加到第
五、第六孔中,再在第
五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul,混勻;混勻後從第
五、第六孔中各取50μl分別加到第
七、第八孔中,再在第
七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl,混勻後從第
七、第八孔中分別取50μl加到第
九、第十孔中,再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl,混勻後從第九第十孔中各取50μl棄掉。(稀釋後各孔加樣量都為50μl,濃度分別為60ng/l ,40ng/l, 20ng/l,10ng/l, 5ng/l)。
2. 加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其餘各步操作相同)、待測樣品孔。
在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然後再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加於酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。
3. 溫育:用封板膜封板後置37℃溫育30分鐘。
4. 配液:將30(48t的20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30(48t的20倍)倍稀釋後備用。
5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩乾,每孔加滿洗滌液,靜置30秒後棄去,如此重複5次,拍乾。
6. 加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。
7. 溫育:操作同3。
8. 洗滌:操作同5。
9. 顯色:每孔先加入顯色劑a50μl,再加入顯色劑b50μl,輕輕**混勻,37℃避光顯色15分鐘.
10. 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。
11. 測定:以空白空調零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(od值)。 測定應在加終止液後15分鐘以內進行。
注意事項:
1. 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘後方可使用,酶標包被板開封後如未用完,板條應裝入密封袋中儲存。
2. 濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結果。
3. 各步加樣均應使用加樣器,並經常校對其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內,如標本數量多,推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標準曲線,最好做復孔。如標本中待測物質含量過高(樣本od值大於標準品孔第一孔的od值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(n倍)後再測定,計算時請最後乘以總稀釋倍數(×n×5)。
5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉汙染。
6. 底物請避光儲存。
7. 嚴格按照說明書的操作進行,試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
8. 所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9. 本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異,以英文說明書為準。
計算:以標準物的濃度為橫座標,od值為縱座標,
在座標紙上繪出標準曲線,根據樣品的od
值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋
倍數;或用標準物的濃度與od值計算出標
準曲線的直線回歸方程序,將樣品的od值
代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋
倍數,即為樣品的實際濃度
試劑盒效能:
1.樣品線性回歸與預期濃度相關係數r值為0.990以上。
2.批內與批見應分別小於9%和11%
檢測範圍:
62.5 pg/ml-4000 pg/ml
靈敏度:
15.6 pg/ml
儲存條件及有效期:
1.試劑盒儲存:;2-8℃。
2.有效期:6個月
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