限制性內切酶是基因工程中最難把握的知識點，高考中對這種酶的考察特別重視，我們有必要對相關的知識先進行歸納，才有利於解答試題。
1 限制性核酸內切酶的基本知識
①**及化學本質:主要是從原核生物中分離純化出來的。化學本質為蛋白質。
②作用：催化作用，可用於dna的切割獲取目的基因和載體的切割，切割的化學鍵為磷酸二酯鍵。
③作用特點：特異性,即限制酶可識別特定的脫氧核苷酸序列,切割特定位點。
④切割方式：錯位切--產生兩個相同的黏性末端，平切--形成平末端。如果是錯位切則將乙個基因從dna分子上切割下來,需要破壞4個磷酸二酯鍵,同時產生4個黏性末端，增加4個游離的磷酸基團。
2 限制性核酸內切酶的難點解析
2.1 目的基因切割要點歸納
①要把目的基因切割下來需要在目的基因的兩邊都進行切割，但絕對不可以破壞目的基因的結構。
②切割目的基因的酶可以用同一種限制酶，也可以用兩種不同的限制酶。
③切割產生的末端有三種情況：都是平末端、都是粘性末端、一邊是粘性末端，一邊是平末端。
2.2 質粒切割要點歸納
①質粒的切割可以切乙個切口，也可以切兩個切口。如果是乙個切口，則連線時可能會產生一些我們不需要的連線物(如自身環化等)；如果是兩個切口則質粒會丟失一段dn**段，但可以控制連線物就是我們需要的目的基因和質粒的連線。切割時注意不要破壞了載體上的標記基因（至少保留有乙個標記基因）、終止子、啟動子、複製原點等。
②切割質粒的酶可以用同一種限制酶，也可以用兩種不同的限制酶。
③切割產生的末端有三種情況：都是平末端，都是粘性末端，一邊是粘性末端，一邊是平末端。
2.3 限制性核酸內切酶的說明
不同的酶識別序列一般不同，但也有識別序列相同的。如果識別序列相同，切割點也相同則切割產生的粘性末端一樣。一種酶的識別序列中可能包含另外一種酶的識別序列，切割時可以產生相同的粘性末端。
不同的酶識別的序列一般不同，但有時也可能相同，這時切割產生的粘性末端也相同。
2.4 酶切割後的dn**段的連線
如果是用一種限制性內切酶切割質粒表達載體和目的基因, 不可以防止載體和目的基因的自身環化,兩個dn**段連線產物有：目的基因—目的基因；目的基因—載體；載體—載體。這些連線物可以環化。
如果是用兩種不同的限制性內切酶切割載體和目的基因, 可以防止載體和目的基因的自身環化, 同時可以防止目的基因和質粒表達載體在酶切後不發生任意連線。兩個dn**段連線產物也有：目的基因—目的基因；目的基因—載體；載體—載體。
這些連線物也可以環化.。
3 試題解析
說明：為了突出重點，高考試題中只是把與限制性內切酶有關的內容保留，其餘內容都進行了省略。
例1 (2008高考海南卷)圖為某種質粒表達載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性內切酶ecori、bamhi的酶切位點，ampr為青黴素抗性基因，tctr為四環素抗性基因，p為啟動因子，t為終止子，ori為複製原點。已知目的基因的兩端分別有包括ecori、bamhi在內的多種酶的酶切位點。
（1）將含有目的基因的dna與質粒表達載體分別用ecori酶切，酶切產物用dna連線酶進行連線後，其中由兩個dn**段之間連線形成的產物有三種。若要從這些連線產物中分離出重組質粒，需要對這些連線產物進行
（2）用上述3種連線產物與無任何抗藥性的原核宿主細胞進行轉化實驗。之後將這些宿主細胞接種到含四環素的培養基中，能生長的原核宿主細胞所含有的連線產物是若接種到含青黴素的培養基中，能生長的原核宿主細胞所含有的連線產物是
（4）在上述實驗中，為了防止目的基因和質粒表達載體在酶切後產生的末端發生任意連線，酶切時應選用的酶是
解析由於目的基因和質粒用同一種限制性內切酶切割，故切割得到的粘性末端一樣，得到的dn**段有兩種，兩兩連線有三種情況。ecori酶切割時會破壞四環素抗性基因，因此插入了目的基因的連線產物就不能抗四環素了。由於ecori、bamhi兩者酶切割後的粘性末端不同，故目的基因和質粒表達載體在酶切後產生的末端不會發生任意連線
答案 （1）目的基因—載體連線物載體--載體連線物目的基因--目的基因連線物分離純化
（2）載體--載體連線物目的基因--載體連線物、載體--載體連線物 （4）ecori和bamhi
例2 (2008高考江蘇卷第32題)將動物致病菌的抗原基因匯入馬鈴薯製成植物疫苗,飼餵轉基因馬鈴薯可使動物獲得免疫力。以下是與植物疫苗製備過程相關的圖和表。
請根據以上圖表回答下列問題:
(5)對符合設計要求的重組質粒t進行酶切。假設所用的酶均可將識別位點完全切開，請根據圖1中標示的酶切位點和表2所列的識別序列，對以下酶切結果作出判斷。
①採用ecor i和pst i酶切,得到種dn**斷。
②採用ecor i和sma i酶切,得到種dn**斷。
解析 ①由於m和x都是ecori酶切割出來的，故兩者的粘性末端一樣，連線之後的序列還是可以被ecori酶識別並切割。psti能在m和n之間專一切點處切開,因此dna將被切割成兩個片段。②ecori仍能切開m與x處,而smai的識別序列是-ccc↓ggg-，因為 n和y重新結合形成的連線處的序列已經不是smai的識別序列了，因此smai不能切割此處了,故只能得到1個dn**段。
答案 (5)①2 ②1
例3 (2009高考江蘇卷第34題)蘇雲金桿菌(bt)能產生具有殺蟲能力的毒素蛋白。下圖是轉bt毒素蛋白基因植物的培育過程示意圖(ampr為抗氨苄青黴素基因),據圖回答下列問題。
(1)將圖中①的dna用hindⅲ、bamhⅰ完全酶切後,反應管中有種dn**段。
(2)圖中②表示hindⅲ與bamhⅰ酶切、dna連線酶連線的過程,此過程可獲得種重組質粒;如果換用bstⅰ與bamhⅰ酶切,目的基因與質粒連線後可獲得種重組質粒。
解析圖中dna上有hindⅲ酶的乙個識別序列、bamhⅰ酶的兩個識別序列，完全酶切則分成四段，其中有兩段的兩端含相同的粘性末端。另外兩段只有一邊含粘性末端。bstⅰ酶與bamhⅰ酶兩種酶的識別序列相同，切出來的粘性末端也一樣。
hindⅲ與bamhⅰ酶切質粒會把質粒上的一段dna切除掉，留下兩個不同的粘性末端缺口，換用bstⅰ與bamhⅰ酶切質粒則只是把質粒切斷，質粒不會丟失dn**段，留下兩個相同的粘性末端缺口。
答案 (1)4 (2)2 1
例4 (2009高考福建理綜卷第32題)轉基因抗病香蕉的培育過程如圖所示。質粒上有pstⅰ、smaⅰ、ecorⅰ、apaⅰ等四種限制酶切割位點。請回答:
(1)構建含抗病基因的表達載體a時,應選用限制酶對進行切割。
解析 (1)從圖可看出,只有pstⅰ、ecorⅰ兩種酶能保持抗病基因結構的完整性,所以構建含抗病基因的表達載體a時,應選用限制酶pstⅰ、ecorⅰ兩種酶,對抗病基因的dna和質粒進行切割。
答案 (1)pstⅰ、ecorⅰ 含抗病基因的dna、質粒
例5 (2009高考上海卷第37題)人體細胞內含有抑制癌症發生的p53基因,生物技術可對此類基因的變化進行檢測。
(3)上圖表示從正常人和患者體內獲取的p53基因的部分區域。已知限制酶e的識別序列為-ccgg-,若用限制酶e分別完全切割正常人和患者的p53基因部分區域(見上圖),那麼正常人的會被切成個片段;而患者的則被切割成長度為對鹼基和對鹼基的兩種片段。
(4)如果某人的p53基因部分區域經限制酶e完全切割後,共出現170、220、290和460對鹼基的四種片段,那麼該人的基因型是 (p+表示正常基因,p-表示異常基因)。
解析 (3)據圖分析可知限制酶e有兩個切點,故正常人會被切成三個片段。(4)由正常人被限制酶e切出來的四種片段可知,該人的基因型是p+p-。
答案 (3)3 460 220 (4)p+p-
例6 （2010高考江蘇卷第27題）下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點，圈l、圈2中箭頭表示相關限制酶的酶切位點。請回答下列問題：
（1）乙個圖1所示的質粒分子經sma ⅰ切割前後，分別含有個游離的磷酸基團。
（3）用圖中的質粒和外源dna構建重組質粒，不能使用srna ⅰ切割，原因是 。
（4）與只使用ecor i相比較，使用bamh ⅰ和hind ⅲ兩種限制酶同時處理質粒、外源dna的優點在於可以防止 。
解析 ⑴質粒切割前是雙鏈環狀dna分子，所有磷酸基團參與形成磷酸二酯鍵，故不含游離的磷酸基團。從圖1可以看出，質粒上只含有乙個smaⅰ的切點，因此被改酶切割後，質粒變為線性雙鏈dna分子，因每條鏈上含有乙個游離的磷酸基團，因此切割後含有兩個游離的磷酸基團。
3 質粒抗生素抗性基因為標記基因，由圖2可知，標記基因和外源dna目的基因中均含有smaⅰ酶切位點，都可以被smaⅰ破壞，故不能使用該酶剪下含有目的基因的dna
4 只使用ecor i，則質粒和目的基因兩端的粘性末端相同，用連線酶連線時，會產生質粒和目的基因自身連線物，而利用bamh ⅰ和hind ⅲ剪下時，質粒和目的基因兩端的粘性末端不同，用dna連線酶連線時，不會產生自身連線產物。
答案 （1）0、2（3）smaⅰ會破壞質粒的抗性基因、外源dna中的目的基因 （4）質粒和含目的基因的外源dn**段自身環化
例7 基因工程中,需使用的限制酶切割目的基因和質粒,便於重組和篩選。已知限制酶ⅰ的識別序列和切點是—g↓gatcc—,限制酶ⅱ的識別序列和切點是—↓gatc—。
(1)根據已知條件和圖回答：
①上述質粒用限制酶切割,目的基因用限制酶切割。
解析限制酶ⅰ的識別序列包含了限制酶ⅱ的識別序列，因此能被限制酶ⅰ識別的序列一定可以被限制酶ⅱ的識別。質粒至少要含有乙個標記基因，故切割質粒只能利用限制酶ⅰ切割，用限制酶ⅱ會把兩個標記基因都破壞。切割目的基因則是兩端都要切割，故選限制酶ⅱ。
質粒DNA的限制性內切酶酶切及其鑑定
2 酶反應終止液 10 兩種反應終止液可供選擇。0.1mol l edta na2，20 ficoll，適量橙g。0.25 溴酚藍，0.25 二甲苯青ff 或稱二甲苯藍 40 蔗糖水溶液 m v 或用30 蔗糖水溶液 實驗步驟 1，質粒dna的酶解 質粒dna酶解的反應成分及加樣量 2，瓊脂糖凝膠板...