綜合性實驗專案指導書
《微生物工程》
編寫單位： 生命科學學院
編寫教師： 閆訓友
適用專業： 生物技術
編寫日期： 2011.5.10
綜合性實驗專案名稱（黑體，四號，全文1.5倍行距）
一、實驗專案：液體培養阿魏側耳發酵液動態變化
實驗學時：8學時
實驗型別：（綜合
每組人數： 5 人/組
二、實驗目的及要求
通過本實驗的學習，使學生學會液體培養阿魏側耳的原理和方法，掌握液體培養條件下的無菌技術，掌握液體培養條件下各因子的動態變化，掌握發酵終點的判斷及汙染處理，為今後從事於微生物發酵奠定基礎。）
三、實驗主要儀器和製劑
主要儀器：恆溫振盪器、超淨工作台、高壓滅菌鍋、分析天平、電磁爐、分光光度計、移液管等。
試劑：蒽酮試劑、3,5-二硝基水楊酸、pda液體培養基、平菇等
四、實驗內容（一級標題：黑體，小四號。下同）
配製pda液體培養基，選擇長勢良好的菌絲，無菌操作挑取數片菌絲，接入液體培養基中，26℃條件下振盪培養，分別取培養0、1、2、3、4、5、6天的培養液，測定發酵液還原糖、總糖、多醣等指標的含量變化，**引起指標變化的原因。
五、實驗實施步驟
（一）製備pda液體培養基
1.pda液體培養基配方：
馬鈴薯20%，蛋白腖0.4％，葡萄糖2％，磷酸二氫鉀0.3％，硫酸鎂0.15％，ph自然。
2.配製、分裝、高壓滅菌：
按照培養基配置的一般方法進行配製液體培養基，並於500ml三角瓶中，分裝150ml pda液體培養基，於121℃下，滅菌30min。
（二）接種培養：
1.取平板菌絲體，利用接種刀均勻劃分等量大小的菌絲體。
2.分別在4個裝有pda液體培養基的三角瓶中，等量接入平菇菌絲體。
3.將接有菌種的pda液體培養基放入27℃下培養。
（三）取樣
分別取接種當天、3天、4天、5天、6天、7天的發酵液。
（四）指標測定
1.還原糖測定按照3,5-二硝基水楊酸的方法。
2.總糖測定按照蒽酮硫酸比色法測定。
3.多醣測定按照多醣=總糖-還原糖
（五）發酵終點的判斷
按照發酵液顏色、發酵液粘稠度、菌絲狀態、還原糖、多醣、總糖的變化進行判斷發酵終點。
六、思考問題
導致液體培養條件下汙染的因素有哪些，實驗過程中如何避免雜菌的汙染，如何正確判斷發酵終點？
七、實驗報告
在實驗報告要包括實驗目的及要求、實驗內容、實驗步驟、實驗結果與分析，明確實驗結果是否與理論相符，如果不符，分析出具體原因及改進措施。
八、實驗成績評定辦法
主要評分點：原理描述、實驗步驟、操作過程、實驗結果、對實驗結果的分析，改進措施和注意事項。其中原理描述、實驗步驟和操作過程清楚正確的60分，實驗結果與分析正確90分，改進措施和注意事項合理完備的100分。
設計性實驗專案指導書
《生物技術綜合實驗》
編寫單位： 生命科學學院
編寫教師： 閆訓友
適用專業： 生物技術
編寫日期： 2011.5.17
設計性實驗專案名稱（黑體，四號，全文1.5倍行距）
一、實驗專案：液體培養藥用真菌發酵液多醣的提取與純化
實驗學時：8學時
實驗型別：（設計性
每組人數： 5 人/組
二、實驗目的及要求
通過本實驗的學習，使學生學會從發酵液中提取多醣的原理和方法，掌握液體離心、發酵液處理的技術，發酵液中多醣的純化方法，掌握冷凍乾燥的技術操作，為今後從事於微生物發酵奠定基礎。）
三、實驗主要儀器和製劑
主要儀器：離心機、冷凍乾燥機、鼓風乾燥箱、恆溫水浴鍋、量筒、燒杯、冰箱等。
試劑：95%乙醇10瓶，工業酒精10l，乙醚2瓶、丙酮2瓶等。
四、實驗內容（一級標題：黑體，小四號。下同）
發酵液離心、發酵上清液的收集、發酵上清液濃縮、發酵液除蛋白、醇沉多醣、多醣的製備、多醣的純化，多醣的結晶。
五、實驗實施步驟
（一）發酵上清液的製備
振盪培養 7d後，從搖床中取出三角瓶，將其在 4000r/min，20min的條件下離心，取其上清液。
（二）多醣的提取工藝
將離心得到的發酵上清液在不大於 90℃的條件下濃縮至原體積的 1/4[11]，濃縮液在 4000r/min，20min的條件下離心，在提取劑為乙醇，乙醇濃度為80％，提取溫度為80℃，提取時間為2.5h小時條件下提取多醣，再將提取液在 4000r/min，20min條件下離心，所得沉澱即為粗多醣。
（三）多醣純化
對製備的多醣，經過純丙酮反覆洗滌，離心後得到固體粉末，再經過乙醚洗滌，洗去色素等雜質，最後得到較好的固體。
（四）多醣的乾燥
對製備的多醣，在冷凍乾燥機內進行冷凍乾燥。
六、思考問題
影響液體多醣提取的因素有哪些，實驗過程中如何避免減少多醣的得率？
七、實驗報告
在實驗報告要包括實驗目的及要求、實驗內容、實驗步驟、實驗結果與分析，明確實驗結果是否與理論相符，如果不符，分析出具體原因及改進措施。
八、實驗成績評定辦法
主要評分點：原理描述、實驗步驟、操作過程、實驗結果、對實驗結果的分析，改進措施和注意事項。其中原理描述、實驗步驟和操作過程清楚正確的60分，實驗結果與分析正確90分，改進措施和注意事項合理完備的100分。
設計性實驗專案指導書
《微生物工程》
編寫單位： 生命科學學院
編寫教師： 閆訓友
適用專業： 生物技術
編寫日期： 2011.6.1
設計性實驗專案名稱（黑體，四號，全文1.5倍行距）
一、實驗專案：澱粉質原料的酒精發酵
實驗學時：10學時
實驗型別：（設計性
每組人數： 5 人/組
二、實驗目的及要求
通過本實驗的學習，使學生學會液體發酵釀製公尺酒的技術，熟悉高溫滅菌技術，掌握酒精蒸餾的方法和步驟，學會測定酒精的方法步驟，為今後從事於微生物酒精發酵奠定基礎。）
三、實驗主要儀器和製劑
主要儀器：恆溫培養箱、超淨工作台、高壓滅菌鍋、分析天平、電磁爐、酒精計、移液管等。
試劑：酒麴，大公尺、罐頭瓶等
四、實驗內容（一級標題：黑體，小四號。下同）
淘洗浸泡糯公尺（淘洗3次，浸泡3~5小時，浸泡後的大公尺應保持完整，手捻易碎，斷面無硬心
蒸飯(時間25~30分鐘，要求蒸出的飯粒外硬內軟，內無白心，不糊不爛)
冷卻：攤晾法，晾到飯溫為30°左右
拌麴（拌曲量一般為公尺重的0.2%~0.3%）
糖化發酵（溫度在28°~30°，一般2~3天即可來酒，香-甜-烈
成熟出汁
酒渣分離
酒精含量的測定。
五、實驗實施步驟
（一）原料製備
1.原料選擇
選擇色澤良好、無蟲蛀、無霉變的優質精白長形糯公尺和大公尺。
2.浸泡
將大公尺（糯公尺）淘洗乾淨後再浸泡，讓公尺充分吸水。浸泡4～5（15小時，浸泡後的糯公尺粒應保持完整，手捻易碎，斷面無硬心，吸水量以25%～30%為宜。
3.蒸飯
將浸好的糯公尺用乾淨紗布包好，放入高壓滅菌鍋內蒸熟。公尺層厚度控制在10厘公尺左右，蒸飯時間控制在30～35分鐘，要求蒸出的飯粒外硬內軟、內無白心、不糊不爛。
4.冷卻
採用攤晾法，將飯粒於無菌條件下攤開冷卻到30℃左右。
5.入罐拌曲
將攤晾的公尺飯裝入罐中，酒麴按照比例，拌入冷卻的糯公尺飯中。
（二）發酵培養
前期進行糖化，品溫控制在28℃~32℃，經過36h~48h 出現酒液，酒液達飯堆的4/5 高度時，可進行開扒攪拌，促進酵母繁殖。主發酵，品溫控制在22℃~26℃，發酵48h~72h。
（三）酒樣理化指標的測定
1.可溶性糖的測定：蒽酮比色法測可溶性糖
1.1葡萄糖標準曲線的製作
稱取2g蒽酮溶於1000ml 85％的硫酸中，即為蒽酮試劑。準確稱取乾燥恒重的葡萄糖20mg，加少量蒸餾水溶解後，以蒸餾水定容到100ml，即為0.2mg/ml葡萄糖標準液。
取6支試管按表2加入試劑後冰浴5min，每管加入4ml蒽酮試劑，沸水浴10min，流水冷卻，靜置10min，在620nm波長下測定吸光度，以葡萄糖含量為橫座標，od值為縱座標，製作標準曲線，見附錄1。
表2 蒽酮比色法測定可溶性糖的標準曲線
1.2蒽酮比色法測定酒樣可溶性糖的含量
取酒樣，稀釋到1000倍，按表3加入試劑，以1號試管作為對照管，2，3，4號試管在波長620nm條件下比色測得od值後，從標準曲線上查出樣品液相應的可溶性糖含量。
表3蒽酮比色法測定酒樣中的可溶性糖
2.酒精度的測定：採用蒸餾法[5]
用容量瓶量取100ml酒樣於500ml蒸餾瓶中，加100ml蒸餾水和數粒玻璃珠，裝上冷凝器，以原100ml容量瓶接收餾出液(外加冰浴)，然後開啟電爐緩緩加熱蒸餾，收集約95ml餾出液時，取下，加蒸餾水定容至100ml，搖勻，備用。將上述制得的酒樣倒入潔淨、乾燥的量筒中，靜置數分鐘，待酒中氣泡消失後，放人洗淨、擦乾的酒精計，再輕輕按一下，靜止後，水平觀測與彎月面相切處的刻度示值，同時插入溫度計記錄溫度，根據測得的溫度和酒精計示值，查gb/t 10345-2007中的附錄二，換算成20℃時的酒精度％(體積分數)。
六、思考問題
導致酒精發酵中的汙染的因素有哪些，實驗過程中如何避免雜菌的汙染？
七、實驗報告
在實驗報告要包括實驗目的及要求、實驗內容、實驗步驟、實驗結果與分析，明確實驗結果是否與理論相符，如果不符，分析出具體原因及改進措施。
八、實驗成績評定辦法
主要評分點：原理描述、實驗步驟、操作過程、實驗結果、對實驗結果的分析，改進措施和注意事項。其中原理描述、實驗步驟和操作過程清楚正確的60分，實驗結果與分析正確90分，改進措施和注意事項合理完備的100分。
綜合性實驗專案指導書
《微生物工程》
編寫單位： 生命科學學院
編寫教師： 閆訓友
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