結題報告書
專案名稱：七彩山雞源大腸桿菌產esbls的檢測及藥敏分析
主持人： 施衝旭
所在學院： 牧醫工程學院
專業年級： 08級動物醫學
大學生實驗創新計畫專案
結題報告書
專案名稱：七彩山雞源大腸桿菌產esbls的檢測及藥敏分析
主持人： 施衝旭
所在學院： 牧醫工程學院
專業年級： 08級動物醫學
指導教師: 潘玉善職稱講師
起止年月： 2009 年 10 月至 2010 年 3 月
填寫日期：2010 年4 月 14 日
七彩山雞源大腸桿菌產esbls的檢測及藥敏分析
施衝旭、杜艷麗、馮芬芬、黃旭東、翟明勝
指導老師：潘玉善
摘要：採用全自動微生物鑑定系統（vitek-32）鑑定了8株七彩山雞源大腸桿菌，並對分離菌進行超廣譜β-內醯胺酶（esbls）的檢測，及對14種抗菌藥和2種複方藥物進行敏感性測定。結果顯示，分離的8株菌大腸桿菌均不產esbls，對藥敏試驗結果表明該珍禽養殖場分離的大腸桿菌對獸醫臨床中常用的3大類抗菌藥（氟喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類）9種藥物均產生高度耐藥，顯示出嚴重的多重耐藥性。
關鍵詞：七彩山雞；大腸桿菌；超廣譜β-內醯胺酶（esbls）；藥敏分析
七彩山雞是珍禽品種中養殖比較簡單、抗病力強、市場銷路大，已在我國南北各地得到普及發展的優良珍禽品種。但近年來，隨著養殖規模和養殖區域的擴大，一些常見條件性致病菌如大腸桿菌，也像肉雞場、蛋雞場那樣常發，給養殖戶帶來很大的損失。目前，雞大腸桿菌病的**主要依靠抗菌藥，但隨著抗菌藥的廣泛、大量甚至不規範使用，細菌耐藥性的產生越來越嚴重，給臨床預防和控制該病造成很大困難。
2023年7月，滎陽某珍禽****飼養的七彩山雞於20日齡時開始發病，經藥物**無效後，送我室求診，根據其發病情況、臨床症狀、剖檢變化及vitek-32全自動微生物鑑定儀鑑定，確診為大腸桿菌感染。為探明該雞場藥物防治失敗的原因，本試驗對臨床分離的8株雞大腸桿菌進行了esbls檢測，並用標準k-b紙片法測定了8株菌對14種抗菌藥物及2種複方藥物的敏感性，以便為掌握雞大腸桿菌產esbls情況以及臨床合理選擇抗菌藥提供科學理論依據。
1 材料和方法
1.1材料
1.1.1菌株**
8株試驗菌源於2023年7月自滎陽某珍禽****送檢患病死亡的七彩山雞肝臟和心臟分離，並經vitek-32全自動細菌鑑定儀鑑定的大腸桿菌。質控菌株：大腸埃希氏菌atcc25922（由中國普通微生物菌種儲存中心提供），肺炎克雷伯菌atcc700603 （由北京大學醫學部提供）。
1.1.2藥敏紙片
藥敏紙片：頭孢他啶caz、頭孢噻肟ctx、氨曲南azt均為30 μg/片，頭孢他啶/棒酸caz/ca、頭孢噻肟/棒酸ctx/ca均為30 /10 μg/片；阿公尺卡星（an）、氨苄西林(am)、環丙沙星(cip)、慶大黴素(gm)、鏈黴素(s)、妥布黴素(tm)、新黴素(n)、公尺諾環素(mno)、多西環素(do)、氨苄西林/舒巴坦(am/su)、左氧氟沙星(lvf)、諾氟沙星(nor)、磷黴素(fos)、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶(sxt)，以上藥物均為北京天壇藥物生物技術開發公司生產。
1.1.3培養基
麥康凱瓊脂、mh瓊脂、胰蛋白腖大豆肉湯均購自廣東環凱微生物科技公司，ss瓊脂購自杭州天和微生物試劑****。
1.1.4儀器
vitek-32全自動微生物鑑定系統和gni革蘭氏陰性菌鑑定卡：法國生物梅里埃公司產品；超淨工作台（蘇淨集團安泰公司製造），隔水式電熱恆溫培養箱（上海躍進醫療器械廠）等。
1.2方法
1.2.1細菌的分離、鑑定
無菌從病死雞中挑取少許心、肝組織接種於tsb增菌液中增菌培養18 h，再次劃線接種於麥康凱瓊脂平板上和ss瓊脂平板上，37℃恆溫培養18 h後挑取在麥康凱瓊脂平板和ss瓊脂平板上單個典型菌落進行純培養。經塗片、染色、鏡檢，證實為純培養物，將其作為試驗受試菌株。然後經vitek-32全自動微生物鑑定系統進行鑑定。
1.2.2 esbls的檢測
按美國臨床實驗室標準化協會（clsi）推薦的表型確證試驗法進行：將濃度為0.5個麥氏單位的受試菌液用無菌棉籤塗佈於mh平板，分別兩兩對應貼上頭孢他啶（caz，30 μg/片），頭孢他啶/棒酸（caz/ca，30 μg/10 μg/片），頭孢噻肟（ctx，30 μg/片），頭孢噻肟/棒酸（ctx/ca，30 μg/10 μg/片）紙片，37℃培養16 h，測量抑菌圈大小。
當兩組藥物中有任意一組中有加ca的抑菌圈直徑比不加ca的抑菌圈直徑相差≥5 mm，即確定為產esbls菌株。
1.2.3藥物敏感性試驗
採用標準k-b紙片法，測定藥物對細菌的抑菌圈大小（mm），試驗結果按照clsi [7]標準判讀敏感、中介和耐藥。
2 結果與分析
2.1細菌分離鑑定結果
臨床分離的8株細菌在麥康凱瓊脂平板和ss瓊脂平板上均形成粉紅色菌落；分離株經純化培養後，經vitek全自動細菌鑑定儀和gni+革蘭氏陰性菌鑑定卡鑑定，結果為大腸桿菌。
2.2 esbls檢測結果
8株山雞大腸桿菌產esbls的表型確認試驗結果見表1，從表1可以看出：在確證試驗中8株菌由ctx或caz在加酶抑制劑與不加酶抑制劑的抑菌圈直徑差均小於5 mm，確認為不產esbls菌株。各藥對質控菌的抑菌圈均符合clsi規定的標準。
表1 8株七彩山雞大腸桿菌疑似產esbls的菌株的表型確認試驗結果（抑菌圈直徑單位：mm）
2.3 藥敏試驗結果
用標準k-b紙片法測定14種藥物和2種複方藥對細菌的抑菌圈大小（mm），試驗結果按照clsi [7]標準判讀敏感、中介和耐藥。測定結果如表2和表3。
表2 14種藥物和2種複方對8株山雞大腸桿菌的抑菌圈大小（單位：mm）
表3 8株臨床分離菌對試驗中所用抗菌藥的耐藥情況
注：新黴素是按阿公尺卡星的判斷標準
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