考馬斯亮藍r-250及g-250染料
考馬斯亮蘭g-250；
名稱：考馬斯亮蘭g-250
別名：考馬斯亮蘭g250，酸性藍90，考馬斯亮藍g，康美賽藍g-250，亮藍g
英文：coomassie brilliant blue g-250
cas：6104-58-1
相對分子量：854.04
分子結構：
性狀：暗藍-紫-棕色結晶粉末。水中溶解度：40 g/l （20℃），溶於甲醇、乙醇；
介紹及用途：考馬斯亮蘭g-250用於凝膠電泳和蛋白質染色。不用滲透到膠裡就比萘酚藍黑b1（naphthol blue black b1）靈敏度高3倍，簡單而又靈敏；可以進行各種蛋白檢測，和勞里反應相牽連的化學物質和游離氨基酸對此蛋白染色檢測無任何影響。
也是p2x7嘌呤能受體激動劑。
考馬斯亮蘭法（bradford法）測定蛋白濃度
（一）實驗原理
雙縮脲法（biuret法）和folin―酚試劑法（lowry法）的明顯缺點和許多限制，促使科學家們去尋找更好的蛋白質溶液測定的方法。
2023年由bradford建立的考馬斯亮蘭法（bradford法），是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優點，因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。
考馬斯亮蘭g-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm變為595nm，溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。經研究認為，染料主要是與蛋白質中鹼性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。
在595nm下測定的吸光度值a595，與蛋白質濃度成正比。
bradford法的突出優點是：
（1）靈敏度高，據估計比lowry法約高四倍，其最低蛋白質檢測量可達1mg。這是因為蛋白質與染料結合後產生的顏色變化很大，蛋白質－染料複合物有更高的消光係數，因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比lowry法要大的多。
（2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成乙個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由於染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩定性最好。
因而完全不用像lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。
（3）干擾物質少。如干擾lowry法的k+、na+、mg2+離子、tris緩衝液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、edta等均不干擾此測定法。
此法的缺點是：
（1）由於各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用於不同蛋白質測定時有較大的偏差，在製作標準曲線時通常選用 g―球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。
（2）仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去汙劑、 triton x-100、十二烷基硫酸鈉（sds）和0.1n的naoh。
（如同0.1n的酸干擾lowary法一樣）。
（3）標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。
（二）試劑與器材
1. 試劑：
（1）標準蛋白質溶液，用 g―球蛋白或牛血清清蛋白(bsa)，配製成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標準蛋白質溶液。
（2）考馬斯亮蘭g―250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭g―250，溶於50ml 95%的乙醇後，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1公升。
2. 器材：
（1）可見光分光光度計 （2）旋渦混合器 （3）試管16支
（三）操作方法
1. 標準方法
（1）取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其餘試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標準蛋白質溶液給各試管分別加入：0、0.
01、0.02、0.04、0.
06、0.08、0.1ml，然後用無離子水補充到0.
1ml。最後各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭g―250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產生大量氣泡而難於消除）。
未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10 管。
（2）加完試劑2~5分鐘後，即可開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值a595，空白對照為第1號試管，即0.1mlh2o加5.0mlg―250試劑。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用後立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡。
（3）用標準蛋白質量（mg）為橫座標，用吸光度值a595為縱座標，作圖，即得到一條標準曲線。由此標準曲線，根據測出的未知樣品的a595值，即可查出未知樣品的蛋白質含量。
0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.50。
2. 微量法
當樣品中蛋白質濃度較稀時（10－100mg/ml）,可將取樣量（包括補加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白對照則分別為0.
5ml或1.0ml h2o, 考馬斯亮藍g－250試劑仍加5.0ml, 同時作相應的標準曲線，測定595nm的光吸收值。
0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.29。
考馬斯亮藍r-250；
1 名稱：考馬斯亮藍 r-250
別名：亮藍r；考馬斯亮藍r；考馬斯燦爛藍；康美賽藍r-250；
英文：coomassie brilliant blue r-250
cas：6104-59-2
相對分子量：854.04
分子結構：
性狀：暗藍-紫-棕色結晶粉末。水中溶解度：40 g/l （20℃），溶於甲醇、乙醇；
介紹及用途：考馬斯亮蘭g-250用於凝膠電泳和蛋白質染色。不用滲透到膠裡就比萘酚藍黑b1（naphthol blue black b1）靈敏度高3倍，簡單而又靈敏；可以進行各種蛋白檢測，和勞里反應相牽連的化學物質和游離氨基酸對此蛋白染色檢測無任何影響。
也是p2x7嘌呤能受體激動劑。
考馬斯亮藍r-250與g-250的區別
一般r250染蛋白，g250一般測蛋白濃度，也可染膠，敏感性更高，但較慢，脫色較難。
g250常用的蛋白染料，作定性試驗用，染色後為藍綠色；r250較敏感,，做定量實驗用，染膠效果較好，染色後為紅藍色。
考馬斯亮藍r250（coomassie brilliant blue r250）。c45h44o7h3s2na，mw=824，λmax=560~590nm。染色靈敏度比氨基黑高5倍。
尤其適用於sds電泳微量蛋白質染色。但蛋白質濃度超出一定範圍時，對高濃度蛋白的染色不符合beer定律，用作定量分析時要注意這點。
考馬斯亮藍g250，又名xylene brilliant cyaning。比考馬斯亮藍r250多二個甲基。分子式 c47h50n3o7s2+ mw=854；λmax=590~610nm。
染色靈敏度不如r250，但比氨基黑高3倍。優點在於它在三氯乙酸中不溶而成膠體，能選擇地染色蛋白而幾乎無本底色。所以常用於需要重複性好和穩定的染色，適於作定量分析。
考馬斯亮藍r-250染色液配製方法
組份濃度：
0.1％（w/v）考馬斯亮藍r-250，25%（v/v）異丙醇， 10％（v/v）冰醋酸
配製量： 1l
配製方法：
1.稱取1g考馬斯亮藍r-250,置於1l燒杯中。
2.量取250ml的異丙醇加入上述燒杯中，攪拌溶解。
3.加入100ml的冰乙醋酸，均勻攪拌。
4.加入650ml的去離子水，均勻攪拌。
5.用濾紙出去顆粒物質後，室溫儲存。
考馬斯亮藍的三種染色法：
考馬斯亮藍染色法——標準方法
1．電泳後，將凝膠轉入一潔淨的玻璃或塑料容器中。加入5倍於凝膠體積的0．25％考馬斯亮藍r—250(溶解於50％甲醇和10％乙酸中)。
2．室溫下振搖溫育4h至過夜。
3．去除染色液，收集儲存可重複使用20～40次。
4．依次在25％甲醇、7．5％乙酸中室溫振搖下脫色。靈實驗室前沿敏度為0．1～0．5ttg蛋白／每條帶。
注：①使用加熱的染液或脫色液可以縮短染色或脫色的時間。將染液或脫色液在微波爐或水浴中加熱(大約50-6013)。
染色時間可縮短至20min，脫色時間約1—2h。②加入泡沫橡膠(海綿)、羊毛狀物或其他物品吸收染料，可以加快脫色時間，特別是在室溫下脫色時。
考馬斯亮藍染色法——快速方法
1．將凝膠放入一潔淨的玻璃或塑料培養皿中加入5倍於凝膠體積的0．25％考馬斯亮藍r-250(溶解於50％三氯乙酸中)。
2．室溫下振搖溫育20min。
3．去除染色液，收集儲存可重複使用多次，用水洗去未與凝膠結合的染料。
4．加入數倍體積的脫色液(25％甲醇、7％乙酸)。必要時更換脫色液，將凝膠加溫或在脫色液中放入海綿、濾紙片等吸收殘餘的染料，有助於加快脫色。靈敏度為1．0ug蛋白／每條帶。
考馬斯亮藍染色法——最高靈敏度
1．染色前，考馬斯亮藍g-250(系考馬斯亮藍r-250的二甲基化衍生物)必須純化。因為商品製劑中的雜質可增強染色背景。在 250m17．5％乙酸中溶解4g染料，加熱到70℃；加入44g硫酸銨，溶解後，冷卻過濾或置室溫離心(3000g，10min)，去除上清液，讓染料乾燥。
實驗室前沿
2．配製染色液：在500m1 2％磷酸中溶解30g硫酸銨，待其完全溶解後，加入溶於10m1水中的0．5g純化的考馬斯亮藍g—250。室溫儲存。
3．電泳後，將凝膠放入一潔淨的玻璃或塑料容器中加入5倍於凝膠體積的12．5％三氯乙酸。
4．室溫下振搖溫育1h或更長時間。
5．排乾液體。搖動考馬斯亮藍g—250染液，使大顆粒膠體分散，加至凝膠內。
6．室溫下振搖溫育過夜。
7．將染液倒回貯液瓶以備重複使用。用水或常規脫色液清洗凝膠並觀察脫色效果。
8．為了使膠體染料固定在蛋白質上，可再加入5倍體積的20％硫酸銨並於室溫下振搖溫育過夜。凝膠固定後，可重複染色增大靈敏度。從步驟5開始進行重複。
靈敏度為0．05～0．1ttg蛋白／每條帶。
——**：實驗室前沿
參考文獻
syrovy,i. and hodny,z. (1991).j. chromatogr.569,175-196.
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