產殼聚醣酶菌株構建

2023-01-11 02:15:02 字數 1626 閱讀 1350

基因工程(geneticengineering)又稱基因拼接技術和dna重組技術,是指在分子水平上對基因進行操作的複雜技術,是將外源基因通過體外重組後匯入受體細胞內,使這個基因能在受體細胞內複製、轉錄、翻譯表達的操作。目前該技術已廣泛應用於食品飲料、環境治理、改良農作物品種及臨床診斷和基因治理等各個領域。

殼寡糖作為繼生命五大要素蛋白質、碳水化合物、脂肪、維生素、礦物質之後的「第六要素「,具有提高生物體免疫力、降三高、抗氧化、改善腸道微生物群落、抑腫瘤、增強骨質、保護神經等功效。但,殼寡糖來之不易,由蝦蟹殼經脫蛋白去鹽分成為殼聚醣後,採用生物酶法(殼聚醣酶)催化降解生成殼寡糖。目前,由於沒有掌握高產殼聚醣酶的核心技術,國內很多公司採用物理化學方法生產殼寡糖,導致環境汙染嚴重、殼寡糖品質差等一系列問題。

或者殼聚醣酶的生產還停留在細菌、真菌的自然產酶,發酵條件複雜、酶的產量低導致殼寡糖生產成本高。21世紀是生命的世紀,基因工程技術在過去幾十年中,取得突破性的進展,採用dna重組技術可構建高產殼聚醣酶工程菌。具體的方法分享如下:

一、 獲取目的基因

目的基因是指在基因工程設計和操作中,被用於基因重組、改變受體細胞性狀和獲得預期表達產物的基因,植物抗病基因、人胰島素基因都是目的基因。在此,殼聚醣酶基因就是目的基因。獲取目的基因的方法有直接從供體細胞的dna中分離或是人工合成基因。

近幾年由於基因測序、基因合成的成本越來越低,也可對細菌基因組、真核生物的轉錄組測序,然後功能驗證就可獲取目的基因。

殼聚醣酶基因主要存在於微生物(細菌、真菌),在低等藻類、少許高等植物像韭菜洋蔥等也有殼聚醣酶的基因。如下圖是bacillus sp. strain kctc 0377bp 的殼聚醣酶基因和氨基酸序列。

該基因cns 45 長度1362鹼基,表達殼聚醣酶45kda。方框中鹼基aaggag是sd序列,核醣體結合位點;垂直箭頭是訊號肽切割位點;對向箭頭是反向互補終止位點。

二、 構建表達載體

載體是攜帶外源目的進入受體細胞複製、整合、表達的工具,包括質粒、噬菌體、酵母人工染色體、細菌人工染色體等各種載體。基因構建表達載體是基因工程的核心,也就是將目的基因與表達載體結合。表達載體含有四部分:

目的基因、啟動子、終止子。如果將基因cns 45結合到質粒載體上需要如下步驟:1.

引物設計(primer、dnastar),引物外連線合適的內切酶;2. pcr擴增目的基因,用凝膠電泳和dna測序驗證序列;3. 酶解並連線目的基因和載體;4.

轉化驗證。在選擇質粒載體時,為了增強殼聚醣酶的表達,可選用強啟動子、iptg誘導的載體。質粒載體有pbr系列。

三、 載體匯入受體細胞

現用於基因工程的受體細胞有大腸桿菌、農桿菌、酵母及動植物細胞,載體進入細菌有非常成熟的技術cacl2誘導和電轉化。將載體倒入受體動植物細胞的方法主要是借鑑細菌或病毒侵染細胞的途徑。細菌表達菌株有大腸桿菌bl22等。

四、 目的基因檢測與表達

目的基因匯入到受體細胞後,需要通過檢測和鑑定才可知目的基因能否穩定維持並高效表達目的產品。檢測的方法有southern,判斷目的基因是否進入受體細胞,驗證表達產物經過分離純化後的性質與功能。如胞外產殼聚醣酶工程菌,可測量發酵液的殼聚醣酶活性。

那麼為什麼工程菌高產殼聚醣酶呢?首先,工程菌種即受體細胞的培養條件得到了最大優化,並且載體質粒是鬆弛型質粒,可在細胞內有10-100多個拷貝;其次,載體上採用的是強啟動子,當有誘導劑存在是持續表達目的生物酶,並且有訊號肽轉運。

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