第四章迴圈水微生物監測分析
第一節異養菌的測定—平皿計數法
1.適用範圍：
本法適用於原水、生活用水、工藝迴圈冷卻水中異養菌的測定。
2.方法原理：
利用平皿計數技術在29±1℃培養72h來測定水中異養菌總數。
3. 試劑與材料
3.1 培養基製備所需試劑，使用生化試劑或分析純試劑
3.2 生理鹽水：0.85%
3.3 乙醇溶液：755（v/v）
3.4 醫用脫脂棉
3.5 醫用紗布
3.6 牛皮紙、繩、皮筋
4.儀器:
4.1 sw—cj—if型淨化工作台
4.2 蒸氣壓力滅菌鍋
4.3 生化培養箱/隔水式電熱恆溫培養箱
4.4 電熱乾燥箱（溫度可控制在60~280±2℃）
4.5 刻度吸量管：1ml
4.6 培養皿 490mm
4.7 三角瓶：250ml
4.8 試管 10×100mm
4.9 稱量瓶
5.準備工作:
5.1 營養瓊脂培養基的配製:
蛋白腖 10.0g
牛肉膏 3.0g
氯化鈉 5.0g
瓊脂 15.0g
蒸餾水 1l
先取1l 蒸餾水於2000ml燒杯中，依次加入適量牛肉膏、蛋白腖、氯化鈉和瓊脂後，加熱溶解至透明後取下，趁熱經四層厚的紗布過濾到另乙個洗乾淨的大燒杯中，用0.1mol/l的naoh溶液調其ph值約7.5左右，然後分裝在洗淨的錐形瓶中，每瓶約150ml，用紗布包好的脫脂棉塞子塞緊瓶口，然後用牛皮紙包住瓶口，用繩子紮緊，放入蒸汽壓力滅菌鍋中消毒，達到0.
15mpa（即121℃）後繼續加熱滅菌半小時即可。
5.2 稀釋水（生理鹽水）的配製：
將8.5g氯化鈉溶解在1l蒸餾水中，此溶液濃度為0.85%。
將配製好的生理鹽水用吸量管轉移到用蒸餾水清洗乾淨的試管中，每管均為9.0ml，管口用紗布包的脫脂棉塞子塞緊，六根試管放在一起用牛皮紙包為一捆用繩紮緊，豎直放置。高壓消毒同5.
1。5.3 移液管滅菌:
用蒸餾水洗淨的吸量管用75%乙醇沖洗內壁後，再用淨紙（或報紙）將每支管子獨立包裝，放入烘箱中160℃滅菌2h，備用。
5.4 培養皿滅菌:
用蒸餾水洗淨的培養甲，再用75%乙醇擦洗內壁和外部，9個一組，用報紙包紮，放入烘箱中160℃滅菌2h，備用。
5.5 取樣瓶的滅菌：同亞硝酸細菌測定中5.4
6.操作步驟:
6.1 水樣採集:
將水樣徹底攪動均勻，方法是上下（或前後）搖動25次。搖動的幅度大約0.3公尺，所花的時間為7秒鐘，其餘同鐵細菌的測定中6.1。
6.2 淨化工作台滅菌
將已經高溫高壓滅菌的生理鹽水、培養基、1ml吸量管、培養皿取樣三角瓶適量放入淨化工作台中紫外線滅菌30min。
6.3 先將培養基融化後置於45±1℃的水浴中保溫，到了使用之前才能取出。若發現培養基中含有沉澱物就應該棄去不用。
6.4 檢驗之前，在每個培養皿上標明水樣號碼、稀釋度、日期和其他任何應有的說明。每個稀釋度至少要準備兩個重複的培養皿。
6.5 水樣稀釋與接種:
6.5.1 將水樣放入滅過菌的淨化工作台中，立即用75%（v/v）乙醇溶液浸泡過的醫用脫脂棉或紗布擦手，點燃無菌室內的酒精燈。
下面操作在淨化工作台的火焰區進行。用1ml滅菌吸量管吸取水樣1ml注入到9.0ml的空白稀釋水中，充分搖勻，此時稀釋度為10-1，另取1支1ml滅菌吸量管吸取1ml稀釋度為10-1水樣注入第二個空白稀釋水中，充分搖勻，此時稀釋度為10-2。
依次做10倍遞增，稀釋到10-5倍即可。當吸取水樣時，不要把吸管尖插入液面之下超過2.5cm深。
放出水樣時，吸管尖不要觸及稀釋水。
6.5.2 將每乙個稀釋度的水樣吸取1ml移入滅菌後的培養皿中，管尖端與培養皿底成45°的角度相接，皿蓋要適當提起，使吸管恰足以插入，放完後停留2到4秒。
移開吸管時不宜再碰到平皿。依次將10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀釋度的水樣分裝到培養皿中，每接乙個稀釋度再換一支滅菌吸管。每個稀釋度需做二到三平行。
6.5.3 灌皿：
將融化後溫度約45±1℃的培養基灌入已移入水樣的培養皿中，每個平皿至少10—12ml，灌皿之後要將融化的培養基和其中定量的試驗水樣徹底混合。方法是握住平皿，先往乙個方向畫圓，再朝相反方向迴轉。小心勿使這個混合液體濺到培養皿的邊緣。
其間所用時間不超過20分鐘（最好在10分鐘內完成）。讓平皿培養基於水平位置靜置10分鐘左右固化，固化後倒置平皿。
6.5.4 空白對照：將培養基灌入加有1ml空白稀釋水的無菌平皿中，作空白對照檢查。若空白培養皿出現菌落，表明測定結果有汙染，測定無效。
6.6 培養:
在恆溫培養箱中於29.8℃培養72±4小時，檢查培養基和稀釋水的無菌性。
7. 計數與報告:
7.1 培養到期後，取出平皿立即計數，計數應選擇那些具有30—300個菌落的平皿。如果計數必須暫緩執行，平皿則需放在5~10℃且不超過24小時。
對於每一批次水樣的無菌對照，都要將結果記錄在報告單上。
7.2 乙個稀釋度有兩個平皿時，應採用兩個平皿的平均菌落數。若乙個平皿有較大的蔓延菌落生長時，則不宜採用，而應以無蔓延菌落生長的平皿作為該稀釋度的菌落數。
若蔓延菌落不到平皿一半，而其餘一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平皿乘2以代表全菌落數。如果平皿上有過多的蔓延菌落生長，在記錄上應寫上「蔓延菌落」。如果稀釋有誤，或有雜菌侵染，以致平皿無法記數，則應在記錄上寫成「實驗室事故」。
如果平皿中的菌落數超過300，不要在記錄中寫成「多不可計」。在細菌擁擠分布的平皿上，如果是大於100個菌落/cm2，記錄中便可寫成大於6500。
7.3 計數結果的報告:
7.3.1 稀釋度的選擇
應選擇平均菌落數在30—300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數報告之。若有兩個稀釋度，其生長的菌落數均在30—300之間，則視二者之比如何來決定。若其比值小於2，應報告其平均數，若大於2，則報告其中較小的數字。
（見表例2、例3），若所有稀釋度的平均菌落數均大於300，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數均大於300，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（見表例4）；若所有稀釋度的平均菌落數均小於30，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（見表例5），若所有稀釋度均無菌落生長，則以＜1乘以最低稀釋倍數報告之（見表例6）；若所有稀釋度的平均菌落數均不在30—300之間，其中一部分大於300，而另一部分小於30時，則以最接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（見表例7）。
7.3.2 計算和報告
對所讀出的菌落數值四捨五入，修約成兩位有效數字，再乘以所對應的稀釋度的倍數。有效數字只取最左邊的兩位，以避免在計算標準平皿計數當中，製造虛而無謂精密度和準確度。為了縮短數字後面的零數，也可用10的指數來表示
例：稀釋度選擇及計數結果報告方式
8.允許差：
每人平行樣計數不能使誤差維持在5%之內，與他人的計數比較誤差不能維持在10%之內。
第二節亞硝酸細菌的測定 mpn法
1.適用範圍:
本方法適用於工業迴圈冷卻水及其它水體中亞硝酸菌的測定
2.方法原理:
由氨態氮轉化為硝態氮的過程稱為硝化作用。硝化作用包括由氨轉化為亞硝酸和由亞硝酸轉化為硝酸的兩個連續過程。其相應參與的微生物分別稱為亞硝酸細菌和硝酸細菌，總稱硝化細菌。
本法採用多試管發酵技術，用含氨鹽而無亞硝酸鹽的培養基進種培養，在30±1℃培養14天，若培養基中有亞硝酸根產生，則在點滴比色板小窩中的少許培養液中加入格里斯試劑，培養液會變為紅色，表明有亞硝酸細菌的生長，為陽性反應，採用pn計數，對被測試樣中的亞硝酸細菌進行計數。
3. 試劑與材料:
3.1 培養基製備試劑：需使用分析純試劑
3.2 格里斯試劑
3.2.1 對氨基苯磺酸試劑（a液）：溶解0.6g對氨基苯磺酸於70ml沸蒸餾水中，冷卻後加入20ml濃鹽酸，然後稀釋成100ml，貯於棕色瓶中儲存於冷處備用。
3.2.2 x——萘胺試劑（b液）：溶解 0.6g——萘胺於含1ml濃鹽酸的蒸餾水中，然後稀釋至100ml，貯於棕色瓶中儲存於冷處備用。
3.3 牛皮紙
3.4 醫用脫紙棉、醫用紗布
3.5 稀釋用水：0.85%
4.儀器:
試管：150mm×15mm並配上密封塞子；（其它同異養菌的測定中4.1、4.2、4.3、4.4、4.5）
5. 試驗前準備工作:
5.1 培養基的製備
（nh4）2so42.0g
nah2po40.25g
k2hpo40.75g
mnso4·4h2o0.01g
mgso4·7h2o0.03g
caco35.0g
蒸餾水1000ml
調節ph為7.2，搖勻分裝於150×15mm試管中，每管5ml，注意caco3沉澱，分裝時需攪動均勻，瓶口塞上棉塞，用牛皮紙或報紙包好。121℃高壓滅菌15分鐘。
5.2 無菌稀釋水配製：同異養菌測定中5.2
5.3 移液管中5.3
5.4 取樣瓶滅菌：將洗淨並烘乾後的磨口試劑瓶瓶口和瓶頸用牛皮紙裹好，紮緊置烘箱中於160±2℃滅菌2h。
6.測定步驟:
6.1 水樣採集：同鐵細菌測定中6.1
6.2 淨化工作台滅菌：將裝有稀釋的生理鹽水的試管、裝有培養基的試管、移液管適量放入淨化工作台上紫外線滅菌30分鐘。
6.3 稀釋與接種
6.3.1 稀釋與接種應在無菌空間淨化工作台中進行。
水樣放入滅菌的淨化工作台中，立即用75%（v/v）乙醇溶液浸泡的醫用脫脂棉擦手，點燃酒精燈。稀釋水用0.85%的生理鹽水。
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