一、儀器操作
1) 準備：首先將內層滅菌桶取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。一般來說每次滅菌前都應該加水。
加水不能太少，否則會引起燒乾或者爆裂。 加水最好加去離子水或蒸餾水，這樣產生的水垢少些，而且鍋體不容易被腐蝕。
2）放回滅菌桶，並裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。
3）加蓋，並將蓋上的排氣軟管插入內層滅菌桶的排氣槽內。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓鬆緊一致，勿使漏氣。
4）用電爐或煤氣加熱，並同時開啟排氣閥，使水沸騰以排除鍋內的冷空氣。待冷空氣完全排盡後，關上排氣閥，讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上公升。當鍋內壓力公升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間（在溫度或者壓力達到所需時（一般為121°0.
1mpa），需要切斷電源，停止加熱。當溫度下降時，再開啟電源開始加熱，使溫度維持在恆定的範圍之內。因為溫度太低達不到滅菌效果，太高可能會出危險。
現在市場上手提滅菌鍋實現了控制自動化，不過因為滅菌壓力比較大，最好還是有人在現場比較保險）。
5）滅菌所需時間到後，切斷電源或關閉煤氣，讓滅菌鍋內溫度自然下降，當壓力表的壓力降至0時，開啟排氣閥，旋鬆螺栓，開啟蓋子，10分鐘後取出滅菌物品。如果壓力未降到0時，開啟排氣閥，就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的液體由於內外壓力不平衡而衝出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養基而發生汙染。將準備滅菌的培養基及空玻璃器皿用牛皮紙包好，裝入鍋內套層中，物品放置不宜過多，過擠，鍋內應留出三分之一空間。
然後蓋嚴鍋蓋，採用對角式均勻擰緊鍋蓋上的螺旋，關閉鍋蓋上的氣閥。
二、維護與注意事項：
1.滅菌物品不能堆得太滿、太緊，以免影響溫度均勻上公升。
2.降溫時待溫度自然降至60℃以下再開啟箱門取出物品，以免
因溫度過高而驟然降溫導致玻璃器皿炸裂
3. 在滅菌過程中，應注意排淨鍋內冷空氣，鍋內冷空氣如排放不淨，會影響滅菌效果，達不到徹底滅菌的目的。由於高壓蒸汽滅菌時，要使用溫度高達120℃、兩個大氣壓的過熱蒸汽，操作時，必須嚴格按照操作規程操作，否則容易發生意外事故。
在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比乾熱大，其原因有三：一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質較易凝固，因蛋白質含水量增加，所需凝固溫度降低，二是濕熱的穿透力比乾熱大；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100℃時，由氣態變為液態時可放出2．26kj（千焦）的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。
在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大於水蒸汽的膨脹壓，所以，當水蒸汽中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低於飽和蒸汽的溫度。