2.2.3菌種接種和培養
啟開菌種後接種於蘇通馬鈴薯培養基，置37℃培養2～3周，可在蘇通馬鈴薯培養基上再傳1代或直接挑取生長良好的菌膜，將生產用菌種移種於改良蘇通綜合培養基或其他適宜培養基的表面，置37℃靜置培養1～2周，挑取發育良好的菌膜移種於改良蘇通綜合培養基或其他培養基的表面，置37℃靜置培養8～10周。凡在培養期間或培養終止時，有菌膜下沉、發育異常或汙染雜菌者，應廢棄。
2.2.4收穫及殺菌
培養終止，將培養物於121℃30分鐘殺菌後，過濾除去菌膜及菌體。如濾液需儲存，應加入3.0g/l苯酚或其他適宜的防腐劑，於4～8℃儲存，儲存期不超過30天。
2.2.5 純化
收集濾液進行純化。用三氯乙酸和飽和硫酸銨法分別沉澱蛋白質，採用經批准的方法純化，除菌過濾後即為原液。
2.2.6合併及凍乾
2.2.6.1合併
將不超過5次純化的原液進行合併。
2.2.6.2分裝及凍乾
原液檢定合格後，可根據蛋白質含量將原液稀釋至規定濃度，定量分裝，分裝後立即凍乾。
2.2.7原液檢定
按3.1項進行。
2.2.8儲存及有效期
原液應於2～8℃儲存。液體原液自效價測定合格之日起有效期為5年；凍乾品自效價測定合格之日起，每隔5年應按2.1項進行檢定，合格後可繼續使用。
2.3半成品
2.3.1配製
經檢定合格的原液，用0.01mol/l pbs（ph7.2～7.
4含0.0005%聚山梨酯80及3.0g/l苯酚）稀釋至20iu/ml或50iu/ml。
稀釋時充分搖勻，並逐瓶做無菌檢查（附錄ⅻ a）
2.3.2半成品檢定
按3.2項進行。
2.4成品
2.4.1分批
應符合「生物製品分批規程」規定。
2.4..2分裝
應符合「生物製品分裝和凍乾規程」規定。
2.4..3規格
每瓶1ml、2ml。每1次人用劑量為0.1ml，含tb-ppd 5iu、2iu。
2.4.4包裝
應符合「生物製品包裝規程」規定。
3 檢定
3.1原液檢定
3.1.1外觀
原液凍乾品應為白色疏鬆體。液體原液及凍乾品復溶後應呈棕黃色澄明液體，無不溶物或雜質。
3.1.2復溶時間
凍乾品按標示量加入注射用水後，應於3分鐘內完全溶解。
3.1.3水分
應不高於3.0%（附錄ⅶ d）。
3.1.4純度
3.1.4.1蛋白質含量
依法測定(附錄ⅵ b第二法)。
3.1.4.2多醣與核酸含量
每1mg蛋白質含多醣與核酸總量應不高於0.1mg。
（1）多醣含量測定：以生理氯化鈉溶液稀釋無水葡萄糖標準品，製備0～100μg/ml葡萄糖標準溶液。將硫酸225ml加入到75ml生理氯化鈉溶液中，另稱取蒽酮0.
6g加入10ml乙醇中，將上述溶液混合，配製成蒽酮混合液。分別精確量取1.0ml不同濃度標準葡萄糖溶液以及本品，加入4.
0ml蒽酮混合液，混勻，置沸水浴20分鐘後於波長620nm處測定吸光度，以葡萄糖標準溶液濃度對應其吸光度，用minitab或其他統計學方法求回歸方程，代入本品吸光度，計算多醣含量。
（2）核酸含量測定：取本品2～3ml，採用紫外－可見分光光度法（附錄ⅱ a），於波長260nm處測定吸光度，按e1% 1cm=200計算核酸含量。
3.1.5效價測定
3.1.5.1動物法
將標準品及本品分別稀釋3個不同稀釋度，至少取4只已經結核菌致敏的體重為400～600g的白色雌性豚鼠，去毛後於背部脊柱兩側相對部位，分別皮內注射上述稀釋度本品各0.1ml或0.2ml，於注射後24小時、48小時觀察區域性硬結的縱徑與橫徑（可根據48小時的反應結果判定）。
計算每個稀釋度注射後2天的硬結反應總和或平均面積，並求其比值，每個稀釋度本品與相應濃度標準品的比值應為0.8～1.2。
如不符合上述要求，可調整稀釋度後再測定效價，直至符合要求。
3.1.5.2稀釋度選擇
稀釋度的選擇應能使本品注射後24小時所產生的區域性硬結反應直徑為8～25mm；本品和標準品的反應直徑大小應相似，且本品和標準品的3個稀釋度的劑量對數反應線應基本平行。如本品效價與標準品效價不一致，可用同樣方法複試1次，並算出相當於標準品的效價，進行調整，調整後再重新抽樣測定效價，直至符合要求。
3.1.6無菌檢查
依法檢查（附錄ⅻ a）應符合規定。
3.1.7無有毒分枝桿菌試驗（取消動物法）
取1.0ml本品，分別接種於10支羅氏雞蛋培養基,37℃培養4周,應無分枝桿菌生長。
3.1.8致敏效應試驗
試驗組與對照組分別用體重300～400g未做過任何試驗的豚鼠各3只，試驗組每只豚鼠皮內注射0.1ml含500iu本品，共3次，每次間隔5天。在第3次注射後15天，試驗組與對照組每只豚鼠各皮內注射0.
1ml含500iu本品，連續觀察3天，兩組動物反應應無明顯區別。
3.2半成品檢定
無菌檢查
依法檢查（附錄ⅻ a）應符合規定。
3.3成品檢定
3.3.1鑑別試驗
取已經結核菌致敏的豚鼠至少4只，皮內注射0.2ml本品，注射後24小時本品的平均硬結反應均應不小於5mm。
3.3.2物理檢查
3.3.2.1外觀
應為無色澄明液體，無不溶物或異物。
3.3.2.2 裝量
按附錄ⅰa中裝量項進行，應不低於標示量。
3.3.3化學檢定
3.3.3.1ph值
應為6.8～7.4（附錄ⅴ a）。
3.3.3.2苯酚含量
應不高於3.0g/l （附錄ⅵ m）。
3.3.4效價測定
取已經致敏的體重為400～600g豚鼠，皮內注射0.2ml標準品與本品至少各4只，注射後24小時、48小時各觀察結果1次（可根據48小時的反應結果判定），計算本品和tb-ppd標準品的平均硬結反應（縱橫直徑相加除以2），計算累計值，並求其比值，應為0.8～1.
2。3.3.5無菌檢查
依法檢查（附錄ⅻ a ），應符合規定。
3.3.6異常毒性檢查
依法檢查（附錄ⅻ f），應符合規定。
4 儲存、運輸及有效期
於2～8℃避光儲存和運輸。自生產之日起有效期為1年。
5 使用說明
應符合「生物製品包裝規程」規定和批准的內容。
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