專題六單轉殖抗體

2023-02-10 01:30:05 字數 3447 閱讀 9858

1、抗體:乙個b淋巴細胞只分泌一種特異性抗體。從血清中分離出的抗體產量低、純度低、特異性差。

2、單轉殖抗體的製備

(1)製備產生特異性抗體的b淋巴細胞:向免疫小鼠體內注射特定的抗原,然後從小鼠脾內獲得相應的b淋巴細胞

(2)獲得雜交瘤細胞

①將鼠的骨髓瘤細胞與脾細胞中形成的b淋巴細胞融合;

②用特定的選擇培養基篩選出雜交瘤細胞,該雜種細胞既能夠增殖又能產生抗體。

(3)轉殖化培養和抗體檢測

(4)將雜交瘤細胞在體外培養或注射到小鼠腹腔內增殖

(5)提取單轉殖抗體:從細胞培養液或小鼠的腹水中提取

3、單轉殖抗體的應用

(1)作為診斷試劑,具有準確、高效、簡易、快速的優點。

(2)用於**疾病和運載藥物。

血清抗體與單轉殖抗體的比較:

知識點撥:

1、融合的結果是有很多不符合要求的;如有2個b淋巴細胞融合的細胞等,所以要進行篩選。

2、篩選出能夠分泌所需抗體的雜種細胞。

3、雜交瘤細胞的特點:既能大量繁殖,又能產生專一的抗體。

4、單轉殖抗體的優點:特異性強,靈敏度高,並能大量製備。

5、單轉殖抗體的作用:作為診斷試劑:準確識別各種抗原物質的細微差異,並跟一定抗原發生特異性結合,具有準確、高效、簡易、快速的優點。

用於**疾病和運載藥物:主要用於**癌症**,可製成「生物飛彈」,也有少量用於**其它疾病。

知識拓展:

製備單轉殖抗體過程中的篩選:篩選是將未融合的b淋巴細胞、骨髓瘤細胞以及bb融合、瘤瘤融合的細胞通過選擇培養基淘汰,篩選出b瘤融合的細胞。篩選是將產生特定抗體的b瘤細胞通過細胞培養用相應抗原檢測的辦法篩選出來。

因為從體內取免疫過的b淋巴細胞時取出很多種,形成的雜交瘤細胞有很多種,所以需篩選出產生特定抗體的雜交瘤細胞。

高中生物單轉殖抗體實驗總結

(一)動物的選擇

目前應用最廣的是小白鼠和大白鼠,尤以小白鼠為好。就品系而言以balb/c小白鼠應用最廣,由於所有的小白鼠骨髓瘤系均從balb/c小白鼠系誘導出來。balb/c系小白鼠必須用純系的,雌雄均可,以8~12週齡為宜。

大白鼠也可,能產生較多量的單抗體。現在已經在小鼠雜交瘤的基礎上,發展了小鼠-大鼠,小鼠-人以及人-人雜交瘤技術。

(二)免疫

一般而言,抗原的純度不很重要,特別是免疫原性較強的抗原。

免疫程式、劑量和方法是關係到是否能得到所需要的單抗體的關鍵之一。

正常小鼠脾臟含有能產生各種不同抗體的b淋巴細胞,乙隻純種小白鼠估計能產生1.0×107~5.0×107種不同的抗體。

因此乙隻正常的小白鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤融合,只能有千萬分之一的機會獲得某一種特定抗體。所以為了進步得到某種雜交瘤的機會,必須加強免疫,使產生特異性抗體的b淋巴細胞大量增加。

b淋巴細胞的不同發育階段對獲得陽性雜交瘤也有很大影響。有人以為處在轉化時期的b淋巴細胞可能更易於融合,而免疫以後7~8天,固然是抗體產生的高峰時期,但形成有活力的雜交瘤細胞的可能反而減少。故一般以為加強免疫後的第三天應殺鼠取脾做細胞融合。

1.可溶性抗原(蛋白質) 以1mg/ml~5mg/ml的溶液加等量的弗氏完全佐劑乳化,分多點小鼠皮下注射,總量為0.3ml~0.

6ml,間隔3~5週再同樣注射一次,10天後,斷尾取血一滴,測抗體效價,選滴度高的小鼠做融合試驗。乙個月後可以經靜脈(尾靜脈)給予無佐劑抗原0.2ml~0.

4ml,3~4天後,殺死小鼠取脾做融適用。

2.顆粒性抗原如抗原**方便,可以不加佐劑而增加免疫次數,縮短間隔時間。例如用羊紅血球免疫小白鼠,以1%濃度每只皮下注射0.

2ml,每週2次,共免疫5~8次,取脾前3天,再免疫一次即可。有人以為最後一次免疫劑量要大,大到近於免疫耐受的程度更好。

單抗技術是主要由抗原製備,免疫動物,細胞融合,篩選雜交瘤細胞,轉殖化培養,單轉殖抗體的大量製備與鑑定等一系列實驗組成的實驗系統,其核心部分是細胞融合。細胞融合是單轉殖抗體技術的中心環節,基本步驟是將脾細胞和骨髓瘤細胞混合後加入peg使細胞彼此融合。

實驗原理:b淋巴細胞能夠產生抗體,但在體外不能進行無限**;而骨髓瘤細胞可以在體外無限傳代,但不能產生抗體。將這兩種細胞融合後,用一特殊選擇培養基(hat)阻斷正常細胞或自體融合細胞的dna合成通路,而雜交瘤細胞可利用補救通路合成dna得以生存,且既能產生抗體,又能無限增殖,並以此生產抗體的技術。

實驗方法

材料:balb/c小鼠,sp2/0骨髓瘤細胞,50%peg,不完全培養液,hat培養液,75%酒精,剪刀,鑷子,紗布,離心管,網篩,大小瓶皿,直頭滴管,彎頭滴管,瓶塞,培養瓶蓋,離心管蓋,燒杯(加入37℃水),泡沫板,大頭針,96孔培養板,計時器,顯微鏡,計數板等。

單轉殖抗體技術方法:

顯微鏡下觀察血片或骨髓片,找出異常細胞。

(1)飼養細胞的製備

1.常用balb/c小鼠,拉頸處死,浸泡於75%酒精內,3~5min。

2.用無菌剪刀剪開**,暴露腹膜,剪一小口,用滴管注入5~6ml不完全培養液(嚴禁刺破腸管)。

3.反覆沖洗,將沖洗液吸入15ml離心管,1000rpm5min離心,用完全培養液混懸,調整細胞密度。

(2)sp2/0骨髓瘤細胞的製備

1.選取狀態良好、處於對數生長期的sp2/0骨髓瘤細胞。

2.棄去原瓶中培養上清,用不完全培養液沖洗三遍。

3.再以不完全培養液對細胞進行充分吹打,得到的細胞懸液移入15ml離心管。

4.細胞計數。

(3)脾細胞的製備

1.3天前加強免疫的小鼠,摘眼球取血後,拉頸處死,75%酒精浸泡3~5min。

2.將小鼠固定於泡沫板上,開啟腹腔,取出脾臟,用不完全培養液反覆沖洗。

3.在平皿中的網篩中,用鑷子夾取脾臟進行反覆研磨,邊磨邊滴加不完全培養液,直到脾細胞單個化,將細胞懸液轉入15ml離心管中。

4.細胞計數。根據兩種細胞計數結果,調整懸液用量,配平之後(sp2/0細胞與脾細胞數量比值在1:5~1:10之間),以1000rpm5min離心。

5.棄上清,每管加入5ml不完全培養液,吹打混勻後合併於同一15ml離心管中,再次以1000rpm5min。

6.離心,棄上清,用滴管吸淨殘留液體。

(4)細胞融合

1.前面步驟所得到的細胞沉澱,輕彈離心管管底,使其呈糊狀。

2.在37℃水浴中,輕輕振盪,一邊緩緩加入1mlpeg,邊加邊搖,peg於1min內加完。

3.加完peg之後,將懸液在37℃水浴中靜置1min。

4.繼續在37℃水浴中,邊搖邊加入不完全培養液2ml,於2min內加完。

5.慢慢加入不完全培養液,800rpm,8min。

6.棄上清,加入含1%hat、20%fcs的培養液,輕輕混勻。

(5)在96孔細胞培養板中加入飼養細胞上清,1滴/孔;之後加入融合細胞懸液,1滴/孔。

(6)鏡下觀察96孔板中細胞情況,co2孵箱中培養。

單轉殖抗體技術實驗結果計算:乙隻小鼠可獲得(1~2.5)×108個脾細胞,與(2~3)×107個sp2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合。

顯微鏡下可見單個分散的細胞,細胞培養3~5天後即可出現小轉殖,雜交瘤細胞較大,呈圓形且透明,其它細胞透光性差並逐漸死亡。

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