醋酸纖維素薄膜電泳分析技術是目前臨床常規測定中應用最廣的方法，具有微量、快速、簡便、吸附作用和電滲作用小、分離區帶清晰、靈敏度及解析度高等特點。醋酸纖維素薄膜還可進行透明化處理，便於照相和掃瞄計算結果。廣泛應用於血清蛋白、血紅蛋白、醣蛋白、脂蛋白、結合球蛋白、同工酶的分離和測定。
【目的】
1.掌握電泳法分離蛋白質的原理、操作方法。
2.了解電泳法分離蛋白質的臨床意義。
【原理】
帶電粒子在電場中向與其電性相反的電極泳動的現象稱為電泳。血清中各種蛋白質的等電點大多在ph4.0～7.
3之間，在ph8.6的緩衝液中均帶負電荷，在電場中都向正極移動。由於血清中各種蛋白質的等電點不同，因此在同一ph環境中所帶負電荷多少不同，又由於其分子大小不同，所以在電場中泳動速度也不同。
分子小而帶電荷多者，泳動速度較快；反之，則泳動速度較慢。因此通過電泳可將血清蛋白質分為5條區帶，從正極端依次分為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β-球蛋白和γ球蛋白等，經染色可計算出各蛋白質含量的百分數。
【器材】
醋酸纖維素薄膜（2cm×8cm）、培養皿、濾紙、無齒鑷、剪子、加樣器（可用蓋玻片或或微量加樣器）、直尺、鉛筆、玻璃板（8cm×12cm）、試管、試管架、吸管、電泳儀、電泳槽、分光光度計或吸光度掃瞄計。
【試劑】
1. 巴比妥緩衝液(ph8.6，0.07mol/l，離子強度0.06)
稱取巴比妥鈉12.76g、巴比妥1.66g，加500毫公升蒸餾水，加熱溶解。待冷至室溫後，再加蒸餾水至1000毫公升。
2. 氨基黑10b染色液
稱取氨基黑10b 0.5g加入冰醋酸10ml、甲醇50ml,混勻，加蒸餾水至100ml。
3. 漂洗液
甲醇45ml、冰醋酸5ml，混勻後加蒸餾水至100ml。
4. 洗脫液 0.4mol／lnaoh溶液。
5. 透明液
稱取檸檬酸21g，n-甲基-2-吡咯烷酮150g，以蒸餾水溶解並稀釋至500ml。
【操作】
1. 準備
將緩衝液加入電泳槽的兩槽內，並使兩側的液面等高。裁剪尺寸合適的濾紙條，疊成四層貼在電泳槽的兩側支架上，一端與支架前沿對齊，另一端侵入電泳槽的緩衝液內，使濾紙全部濕潤，此即 「濾紙橋」（圖3-1）。
將醋酸纖維素薄膜切成2cm×8cm大小，在無光澤面的一端約1.5cm處，用鉛筆輕劃一直線，作為點樣位置。然後將無光澤面向下，置於盛有巴比妥緩衝液的培養皿中浸泡，待充分浸透（約20分鐘）即無白色斑點後取出，用潔淨濾紙輕輕吸去表面的多餘緩衝液。
2. 點樣
取少量血清於玻璃板上，用加樣器取少量血清(約2～3μl)，加在點樣線上，待血清滲入膜內，移開加樣器。點樣時應注意血清要適量，應形成均勻的直線，並避免弄破薄膜（圖3-2）。
3. 平衡與電泳
將點樣後的薄膜有光面朝上，點樣的一端靠近負極，平直地貼於電泳槽支架的濾紙上，平衡約5分鐘。蓋上電泳槽蓋，通電進行電泳。調節電壓為100～160伏，電流0.
4～0.6ma／cm寬，夏季通電45分鐘，冬季通電60分鐘，待電泳區帶展開2.5～3.
5cm時斷電。
4. 染色
用無齒鑷小心取出薄膜，浸於染色液中1～3分鐘（以清蛋白帶染透為止）。染色過程中應輕輕晃動染色皿，使薄膜與染色液充分接觸，薄膜量較多時，應避免彼此緊貼而影響染色效果。
5. 漂洗
準備3個培養皿，裝入漂洗液。從染色液中取出薄膜，依次在漂洗液中連續浸洗數次，直至背景無色為止。將漂淨的薄膜用濾紙吸乾，從正極端起依次為清蛋白（a）、α1、α2、β及γ-球蛋白（圖3-3）。
6.定量
(1)洗脫法：取6支試管，編號，分別為a、α1、α2、β、γ和空白管。於清蛋白管加入0.
4mol/lnaoh溶液4ml,其餘5管加2ml。剪下各條蛋白區帶，另於空白部分剪一條與各蛋白區帶寬度近似的薄膜作為空白，分別浸入各管中，振搖數次，置37℃水浴20分鐘，使色澤完全浸出。用620nm波長以空白管調零比色，讀取各管吸光度，按下式計算：
t = a×2 + α1 + α2 + β + γ
清蛋白% ＝ 清蛋白管吸光度×2/t×100
α1-球蛋白% ＝ α1-球蛋白管吸光度/t×100
α2-球蛋白% ＝ α2-球蛋白管吸光度/t×100
β-球蛋白% ＝ β-球蛋白管吸光度/t×100
γ-球蛋白% ＝ γ-清蛋白管吸光度/t×100
(2)掃瞄法：待染色的醋酸纖維素薄膜完全乾燥，置透明液中約3分鐘，取出貼於玻片上，薄膜完全透明。將已透明的薄膜放入全自動光密度計中，對蛋白區帶進行掃瞄，自動繪出電泳圖，並直接列印出各區帶的百分含量。
【注意事項】
1. 標本不能溶血，否則，β球蛋白濃度偏高。
2．每次電泳時應交換電極，以使兩側電泳槽內緩衝液的正負離子相互交換，使緩衝液的ph維持在一定水平。
3．電泳槽緩衝液的液面要保持一定高度，過低可能出現了球蛋白的電滲現象(向陰極移動)。同時，電泳槽兩側的液面應保持在同一水平面，否則，通過薄膜時有虹吸現象，將會影響蛋白質分子的泳動速度。
4．電泳時電泳槽要密閉，以保持濕度，否則，薄膜水分蒸發乾燥，使電流下降，分離不佳。
5．電泳失敗或圖譜不理想的常見原因。
(1)電泳圖譜不整齊：①點樣不均勻；②薄膜未完全浸透或溫度過高致使膜面區域性乾燥或水分補給不足；③緩衝液變質；④電泳時薄膜放置不正，與電流方向不平行。
(2)各蛋白區帶分離不清晰：①點樣過多；②電流過低，多由薄膜過於緻密、吸水性差、導電能力差引起；③膜面乾燥；④薄膜過薄。
(3)清蛋白中間著色淺：①染色時間不夠或染色液陳舊；②清蛋白含量過高，可減少血清用量或延長染色時間。
(4)電泳速度慢：①電流過低；②供給薄膜的緩衝液不足，連線薄膜與緩衝液的濾紙或紗布過薄(一般需4層)；③溫度過低，冬季電泳速度較夏季慢；④薄膜結構過於緻密，導電性差；⑤緩衝液中水分蒸發，致使離子強度增大。
6．樣品要求點在粗糙面(無光澤面)，否則，樣品很難吸人膜內。電泳時最好將點有樣品的一面朝下，以防電泳過程中水分蒸發，影響電泳結果。
7．染色時間以2分鐘為佳(室溫低時，時間可稍長)，若時間過長，可使α1球蛋白與染料結合率增加，導致α1球蛋白百分比上公升。
【正常參考值】
清蛋白57.45～71.73%
α1-球蛋白1.76～4.48%
α2-球蛋白4.04～8.28%
β-球蛋白6.79～11.39%
γ-球蛋白11.85～22.97%
a/g1.24～2.36
【臨床意義】
急慢性腎炎、腎病症候群、腎功能衰竭時，清蛋白降低，α1、α2和β-球蛋白公升高；慢性活動性肝炎、肝硬化時，清蛋白降低，β、γ-球蛋白公升高；急性炎症時，α1、α2-球蛋白公升高；慢性炎症時，清蛋白降低，α2、γ-球蛋白公升高；紅斑狼瘡、類風濕關節炎時，清蛋白降低，γ-球蛋白顯著公升高；多發性骨髓瘤時，清蛋白降低，γ-球蛋白公升高，於β和γ-球蛋白區帶之間出現「m」帶。
【結果及分析】
【思考題】
1.血清蛋白質電泳時為什麼要將點樣的一端靠近負極端？
2.醋酸纖維素薄膜電泳可將血清蛋白依次分為哪幾條區帶，有哪些臨床意義？
牛血清蛋白標準曲線
牛血清蛋白表酚法定製牛血清蛋白及測定人體血清蛋白加樣操作表 樣1樣2試管編號200ug ml牛血清蛋白標準液 ml 0.000.300.400.500.600.700.800.90 1.001.00 1mol 1000ml人血清蛋白 ml ph7.4磷酸緩衝液 ml 1.000.700.600.50...