羅娜，閆俊麗，肖雄，胡思純，何亞男，蔣小平*
（長沙醫學院病原生物學與免疫學教研室，湖南長沙 410219）
摘要目的：比較三黃湯與環丙沙星對耐藥性大腸桿菌體外抑菌作用的差異，**兩者聯合使用的臨床意義；方法：試管稀釋法測定三黃湯、環丙沙星的mic，分批培養法繪製在亞mic濃度下兩者抑菌曲線和組合用藥時抑菌曲線；結果：
三黃湯、環丙沙星的mic分別為450mg/ml、15.63ug/ml；在亞mic濃度下三黃湯對大腸桿菌的抑菌曲線一直保持平穩狀態；而環丙沙星抑菌曲線在起始3-4h內呈下降趨勢，隨後保持較平穩狀態。通過轉接20次培養後，發現三黃湯的mic沒有明顯改變，而環丙沙星mic增至90.
7ug/ml，顯著增高；組合藥物培養時其fic指數<0.5，表現為協同作用；通過不同梯度組合培養測出最佳組合濃度為三黃湯112.5 mg/ml、環丙沙星9.
38ug/ml，在最佳組合濃度培養下，大腸桿菌的抑菌曲線起初表現環丙沙星的抑菌作用，但隨後保持穩定；在組合藥物中轉接20次的大腸桿菌對環丙沙星的藥敏性有所提高，其mic降至11.4ug/ml。
關鍵字三黃湯；環丙沙星；大腸桿菌
第一作者：羅娜 ,女，籍貫：湖南婁底新化，1993-，在校本科生，生物技術專業
通訊作者：蔣小平，男，1983-，碩士研究生，助教，主要從事微生物檢驗研究（
comparative inhibitory effect of sanhuang and ciprofloxacin against
luo na,yan jun-li ,xiao xiong,hu si-chun,he ya-nan, jiang xiao-ping*
(department ofpathogenicbiologyand immunology, changsha medical university, changsha hunan 410219)
abstract: objective: to comparative sanhuang with ciprofloxacin reinstating e.
coli in vitro antibacterial and explore the clinical significance of combination. methods: use tube dilution method to determine the minimum inhibitory concentration（mic） of sanhuang and ciprofloxacin and drawn the bacteriostatic curves when in the conditions of sub-mic concentration.
results: the mic of sanhuang and ciprofloxacin are 450mg/ml and 15.63ug/ml.
when expose to sub- mic of sanhuang, bacteriostatic curves kept flat in the entire times, but decreased quickly in the first 3-4h and then increased to the beginning in the ciprofloxacin liquid. after 20 times serial passage in sub-mic ciprofloxacin, to combination drug culture fractional inhibitory concentration(fic) index <0.5 for synergy ,the mic of ciprofloxacin to rose from 15.
63ug/ml to 90.7ug/ml, while it did not increase in sanhuang. by serial dilutions, the best rate were sanhuang 112.
5mg/ml and ciprofloxacin 9.38ug/ml; bacteriostatic curves growth decreased quickly in the first 3-4h like ciprofloxacin but soon increased to the beginning, it was found that the mic of ciprofloxacin in combination drug dropped to 11.4ug / ml.
key words: sanhuang, ciprofloxacin, e. coli
隨著抗生素的濫用，細菌的耐藥性日趨嚴重，而大腸桿菌(escherichia coli)的耐藥率更是高居首位，呈逐年上公升趨勢。近年來，醫學和獸醫臨床上出現了超強耐藥、多重耐藥性大腸桿菌。由於細菌的耐藥性具複雜性和嚴重性的特點，且多為不同血清型，在臨床上使用疫苗難以達到滿意效果[1]，因而部分或全部恢復對抗生素的敏感性已成為當今人們關注的焦點[2]。
國外主要針對大腸桿菌耐藥機制的研究，而國內對其研究起步較晚，現多研究中草藥對大腸桿菌耐藥性的抑制效果[3]。大量的流行病學調查證實，許多中藥在抑菌方面有著十分重要的作用，這些清熱解毒的天然植物有望成為抗菌藥物的重要資源，有廣闊的開發前景和應用價值[4-5]。迄今為止，國內外尚未發現有關三黃湯和環丙沙星對大腸桿菌抑菌作用的比較報導，通過本實驗的**將為三黃湯**大腸桿菌感染提供一定的中醫藥學應用理論，在臨床**細菌感染以及中藥逆轉大腸桿菌，減少大腸桿菌耐藥性上提供參考。
1材料1.1菌株大腸桿菌菌株（atcc25922），實驗室儲存。
1.2藥物鹽酸環丙沙星（含量98.5%，批號020315-8，江南製藥廠）、三黃湯（中藥黃連200g，黃芩200g，大黃100g）。
1.3培養基採用m-h(mueller-hinton)培養基配製方法參照《臨床檢驗手冊》[6]，lb液體培養基配製：胰化蛋白腖10g+酵母提取液5g+nacl10g,搖動直至溶解，用5mol/l naoh調ph至7.
0，用去離子水定容到1l，在15psi高壓下蒸汽滅菌20min。
1．4儀器 sw—cj—jc型超淨工作台、pyx—ditx型隔承式眩熬匿溫牆葬箱、手提式篷．力蒸汽滅麓器、全鑫動電子分析天平、dzf一6050型真空乾燥箱等。
2方法2.1 菌液製備將貯藏菌種接種在含3%去纖維羊血的m-h培養基上，在5%- 8%co2孵箱37℃培養24h後製成濃度約109cfu／ml的菌液，再一部分稀釋10000倍，使菌懸液約105cfu／ml。
2.2 中藥煎劑製劑中藥有效成分提取製備三黃湯，取藥材於三角燒瓶中，加蒸餾水沒過約5cm，常溫浸漬3h，文火煎煮30min，濾出藥液；加蒸餾水沒過藥材約3cm，煎煮20min,濾出藥液；再加水浸沒藥1.5cm，煎煮15min,濾出藥液；合併三次濾液，調ph至7.
4-7.6；常壓蒸發濃縮至原藥材質量與煎液體積比為1.0g/mol, 4℃儲存備用 [2]。
2.3 單藥最低抑菌質量濃度測定(mic) 採用試管稀釋法,在試管中用液體lb將三黃湯稀釋成1000、500、250、125、62.50、31.
25、15.63、7.82、3.
91、0mg/ml;將鹽酸環丙沙星lb二倍稀釋成250、125、62.50、31.25、15.
63、7.82、3.91、1.
96、0.98、0.49、0.
25、0.13ug/ml;各做三個重複，接種105cfu／ml濃度的大腸桿菌，37℃140轉/分搖床中振盪培養12h後，從適當的稀釋濃度中提取0.1ml塗佈平板計數，分別得到三黃湯和環丙沙星的mic[7]。
2.4 分批培養法在亞mic濃度下，分別在三黃湯（225mg/ml）和環丙沙星（7.82 ug/ml）液體培養基中接種相同濃度(109cfu／ml)的大腸桿菌，以無藥培養基作為對照，37℃140轉/分振盪培養12h，接種後每1h取0.
1ml，稀釋10倍塗佈平板計數，描繪抑菌曲線。再分別轉接到相同培養基中，反覆20次，20次末用試管二倍稀釋法測最低抑菌濃度。
2.5 聯合藥敏試驗[9-10] 採肉湯稀釋棋盤法測定三黃湯與環丙沙星聯合對大腸桿菌atcc25922的體外抑菌活性，以部分抑菌濃度指數（fractional inhibitory concentration index,fic）為聯合藥敏試驗的判斷依據。計算公式：
fic=a/a′+ b/b′。式中a表示甲藥聯合時的mic ，a′表示甲藥單獨時的mic，b表示乙藥聯合時的mic，b′表示乙藥單獨時的mic。當fic指數≤0.
5時為協同作用；＞0.5~1時為相加作用；＞1~2時為無關作用；＞ 2時為拮抗作用[73 結果與分析3.1 最低抑菌濃度測定結果對大腸桿菌atcc25922d的mic三黃湯為450mg /ml，環丙沙星為15.
63ug/ml，兩者相差較遠，表明中草藥相對於抗菌藥物而言其抑菌作用不強。當環丙沙星對大腸桿菌的mic≥4ug/ml時為耐藥[8]，可知大腸桿菌對環丙沙星為耐藥。通過sub-mic20代傳代培養後，三黃湯對大腸桿菌的mic為440mg/ml，較為穩定；環丙沙星對大腸桿菌的mic為90.
7ug/ml，較原始菌株提高了6倍左右，這與臨床上的長期服用一種抗生素所出現的抗藥性相近；提取一定濃度在最佳組合藥物培養下的大腸桿菌，測出環丙沙星對其的mic為11.4ug/ml，顯著降低。
表1 三黃湯與環丙沙星對大腸桿菌的mic值
3.2 三黃湯、環丙沙星聯合用藥對大腸桿菌的藥敏試驗三黃湯與環丙沙星聯合用藥對大腸桿菌atcc25922的fic<0.5,兩藥聯合結果為協同作用，因此兩藥聯用能夠提高抗菌效能。
表2 三黃湯、環丙沙星聯合用藥對大腸桿菌的藥敏試驗
3.3 亞mic濃度下，分別用三黃湯與環丙沙星培養的抑菌曲線 sub-mic三黃湯作用下其抑菌曲線較為平穩，與對照組相比，7h內未見明顯增長，一直以微弱的抑菌作用抑制大腸桿菌的增長，7h後開始有緩慢增長的趨勢；在sub-mic環丙沙星作用下， 3-4h後便降至103以下，說明大腸桿菌明顯受到抑制，4h達到最低水平，但隨後又增長至接種水平，可能是由於存在於原培養基中的抗藥菌株增值所致；組合藥物對大腸桿菌表現為協同作用，在4h內主要體現環丙沙星的高效抑菌作用，隨後隨用藥時間增加，菌落數量增加，10h後保持穩定，但抑菌作用始終強於單藥。（以時間為橫座標，換算出培養液中每毫公升的細菌數作為縱座標）
4 討論
三黃湯與環丙沙星對大腸桿菌的mic值顯示，環丙沙星對大腸桿菌的藥敏性要遠高於三黃湯。但sub-mic下轉接20代後，環丙沙星mic增至原來的六倍左右，說明長時間用抗生素易使細菌產生抗藥性，使得抗藥菌株增多，因而要達到抑菌效果，就必須不斷增大藥物劑量，這為臨床用藥帶來一定的困擾；三黃湯對大腸桿菌的抗菌活性雖不強，但經過20代持續培養後，mic不但沒有增加，反而有略微下降的趨勢，說明大腸桿菌很難對三黃湯產生抗藥性。這可能是由於三黃湯與環丙沙星抑菌機制存在顯著差異，三黃湯的複雜成分的理化作用構成三黃湯的綜合抑菌機制，是全面、持續性的，完全不同於環丙沙星的雙靶位抑菌機制。
在單藥**大腸桿菌時一般優先選用環丙沙星，但易產生抗藥性，不宜通過大幅度提高劑量來提高**效果[11]。
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