發布日期 20071108
欄目化藥藥物評價》化藥質量控制
標題抗生素研發中無菌驗證檢查法的問題與對策
作者邢俊生蔣煜
部門正文內容
審評三部邢俊生＊ 蔣煜
邢俊生＊ 山西省藥檢所
摘要：隨著我國藥品衛生學不斷完善和貫徹執行，以及中國藥典2023年版的執行，多數申請人在該無菌檢查以及無菌驗證工作中逐漸規範，但仍有部分存在一些問題。本文針對在無菌檢查研究和整理申報資料過程中常見問題進行了分析，希望引起研發部門進一步重視對無菌檢查和無菌驗證工作。
一、概述
無菌檢查法系用於檢查藥典要求無菌的藥品、醫療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。中國藥典進一步說明如果供試品符合無菌檢查法的規定，僅表明了供試品在該檢驗條件下未發現微生物汙染。由此可見，無菌檢查法的試驗環境、試驗器具、無菌檢查方法以及樣品三方面因素共同決定了該項檢查結果是否真實可信，並能否反映產品的真實情況。
我國藥品衛生學不斷完善和貫徹執行，促進了我國藥品質量不斷提高。相比中國藥典2023年版，2023年版藥典對無菌檢查的環境要求更一步明確，對單向流空氣區、工作檯面以及環境要求潔淨度驗證之外，尚要求對隔離系統進行驗證。雖然無菌檢查法已經比較成熟，但是由於該方法的特點，以及檢驗過程中可能導致汙染的原因複雜，使無菌檢查法在規範化以及標準化等方面仍有進一步發展的空間。
另外，注射劑、滴眼劑、外用藥劑型、處方工藝設計、輔料使用、無菌生產控制，以及無菌檢查等仍是研究者必須面臨的問題，因此也必須更關注該檢查專案。
通過在審評中心半年的學習，並結合日常在省藥檢所的實際工作，認為在中國藥典2023年版執行兩年多，多數企業在該無菌檢查以及無菌驗證工作中逐漸規範，但仍有部分生產企業存在一些問題，值得**：
二、無菌檢查的現狀
1、多數生產企業的常規工作量大，部分企業相對缺少標準化試驗用儀器，微生物專業人才。對檢驗人員的要求缺少統一的管理，操作沒有規範的要求。中檢所已經編印了《中國藥品檢驗標準操作規範》2023年版，從儀器、裝置、用具、試液、培養基、對照用菌液、抑細菌和抑真菌、檢查法，結果判定等方面對無菌檢查的要求和操作要領進行了規範化描述，但是部分申請人未嚴格執行，應加以注意。
2、檢驗方法本身的問題、可操作性差、檢驗結果不科學嚴謹。薄膜過濾法、直接接種法各自均有一定優缺點，需要在今後的過程中不斷完善和改進，直接接種法可操作性差，在實踐中引入汙染的分險大，需要對環境以及人為操作等因素進行嚴格控制。
3、檢驗方法的驗證、工作系統驗證方法的尚需進一步完善，無菌檢查方法的應用，可以考慮有無必要針對品種的不同特點逐步建立各藥物的、可控的，具體操作的試驗規範。
三、無菌檢查研究中存在的主要問題
1、無菌檢查法的試驗環境
在試驗過程中忽視了對無菌環境引數進行驗證，或者忽視了應用標準化試驗操作對試驗環境進行驗證，並積累驗證資料。
2、試驗器具、裝置
1）培養基、稀釋劑
由於目前的規範尚缺少對培養基的相關驗證要求，對培養基的使用多為按標籤上的濃度進行配製，進行靈敏度檢查後再作為無菌檢查使用。實際上無菌檢查出現在培養基上的問題也不少，應引起足夠重視。由於不同批次培養基的配料以及濃度的差別，和實際操作人員的不同，可能造成相同稀釋倍數的培養基實際濃度不同，粘稠程度不同，以及酸鹼度的不同，有時在對某些產品效價的測定過程中會造成較大誤差。
應對不同濃度培養基的靈敏度和濃度進行驗證，確保在某個濃度範圍內培養基對試驗資料的支援。
藥典納入了兩種稀釋劑，不同稀釋劑針對不同品種的適應性不同，但是目前在對稀釋劑的選擇和操作過程中尚沒有要求進行驗證。試驗中需要對稀釋劑和沖洗液的使用進行必要的驗證，確保稀釋劑和沖洗液的使用對樣品中可能存在細菌和黴菌的相適應性和提供適宜的沖洗液用量，確保在試驗中能夠準確的獲得需要的結果。
中國藥典納入了培養基、稀釋劑的滅菌程式，目前多作為常規操作，可考慮根據每個品種的不同特性進行驗證，選擇提供明確的保證試驗結果的培養基濃度、稀釋劑型別，以及相適應的操作規範。
2）試驗菌
部分申請人在研究過程中對培養基靈敏度檢查和驗證用的菌株驗證結論試驗理論不充分。試驗用菌種的**依據不充分，對菌種的使用不能進行科學有效的管理，導致無菌驗證工作的失敗和資料的不可靠性，應引起足夠重視。
3、樣品因素
某些情況下，容易出現假陰性和假陽性現象，部分申請人不做深入研究和比較。比如：在培養過程中如果溫度控制出現問題會造成在培養期內細菌生長的變化，應該進行必要的驗證和評價。
由於操作者消毒滅菌不徹底或操作失誤造成汙染的風險也應進行了分析和研究。
4、申報資料整理中無菌檢查法常見問題：
對檢驗方法的驗證、培養時間的選擇和結果判斷缺乏系統的評價，應在驗證資料中針對檢查方法進行比較後說明所選擇方法的合理性；並且對不同培養時間和培養溫度濕度的觀察記錄後對細菌的影響，來確定具體的培養時間；最好對不同試驗條件進行比較研究。
對樣品檢驗數量和不同型別供試品的處理方式以及接種方法選擇的驗證沒有完整的評述；中國藥典提供了無菌檢查每批地取樣量，但是當進行驗證時，應針對具體的品種取不同數量的樣品進行驗證比較，這樣驗證資料才能全面完整，針對不同型別的品種無菌檢查的處理方式不同，需特殊處理的樣品應進行比較試驗進行驗證。
在試驗中對稀釋劑和沖洗液的選擇和用量需要進行試驗比較，確定沖洗量及其他關鍵操作步驟。但在申報資料中對上述內容沒有相應的論述。
做出驗證結果的判斷時缺少具體的試驗資料進行表述說明。很多驗證資料的結論僅僅是乙個試驗的結論，應針對驗證的步驟和試驗記錄**現的問題進行討論，經分析比較論證後再確定驗證使用的方法。
四、無菌檢查和驗證方法
無菌檢查法包括：薄膜過濾法、直接接種法。需結合供試品情況選擇合適的方法，並選擇敏感菌株對供試品抗菌活性去除效果進行檢驗。
制定出該品種的標準檢驗操作規程，明確樣品在前處理過程中的處理步驟、採用的具體方法，以及各個環節的操作關鍵。制定標準的技術檔案。
抗菌藥品無菌檢查的關鍵要素包括：1、去除抗菌活性，減少藥物對微生物生長的影響。2、陽性菌的生長作為參考依據。
採取的解決措施，以及對沖洗條件的改善，β-內醯胺類抗生素使用β-內醯胺酶中和，其他抗生素改善沖洗條件試驗，頭孢類抗生素採用400ml稀釋液溶解，沖洗採用0.1%蛋白腖溶液，以下為幾種頭孢類抗生素以及驗證用菌株的適宜沖洗試驗用量的參考：
由於衛生學檢查的複雜性和多樣性，由此導致了試驗結果的不確定性。同時無菌檢查為一次性的報告方式，因此為確保試驗過程規範性和試驗結果的真實性，對方法進行驗證顯得尤為重要。無菌檢查驗證內容包括：
無菌環境的驗證、滅菌器的驗證、培養基靈敏度的驗證、陰性對照、陽性對照等方面的驗證工作。驗證貫穿試驗的整過程。上述過程可避免因陽性菌選擇不合理、方法不合適等因素造成的試驗不科學，資料不可信等現象。
驗證工作需要考慮供試品自身帶來的影響、方法有效性，操作過程的合理性等因素，例如：對於控制菌，在對為消除供試品的抑菌作用所採用中和法、離心沉澱法、薄膜過濾法等方法時進行驗證，應進行對比研究，並要考慮整個試驗過程的連貫性以及對前後過程銜接的影響。供試品中抗菌活性的去除以及供試品對微生物生長的影響也是驗證的重點。
五、對無菌檢查驗證工作的建議
考慮到微生物限度和無菌檢查的複雜性和多樣性，以及檢查方法的不斷創新和改善，在試驗過程中需結合供試品情況選擇合適的方法，選擇敏感菌株對供試品抗菌活性去除效果進行檢驗。制定出該品種的標準檢驗操作規程，明確樣品在前處理過程中的處理步驟、採用的具體方法，以及各個環節的操作，制定標準的技術檔案。
生產企業需要建立無菌微生物檢查的長效培訓機制，建立培訓和管理機制，不斷培訓和了解當前檢驗方法。建立質量保證體系包括人員、試驗室條件和管理，檢驗方法的規範化；標準菌株的使用和管理，試驗菌液的製備的規範，需要建立規範化的研究體系。建立微生物學檢驗研究標準化的平台非常重要。
生產企業在進行無菌驗證的過程中應逐步完善對驗證方法的研究，採用有效的手段不同的方法和試驗條件進行比較，豐富驗證的內容，提高驗證技術水平。
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