課程設計說明書
課程名稱：生物分離工程
設計題目：牛血清白蛋白的分離提純工藝
院系：環境與化學工程學院
學生姓名：孫盼盼
學號：41004020111
專業班級：10級生物工程01班
指導教師：王曉軍
2023年6月20日
目錄1.設計任務書1
2.設計背景1
2.1 牛血清白蛋白分離提純的簡介1
2.2 牛血清白蛋白分離提純的意義1
3.設計原理2
4.設計工藝流程及設計方案說明2
4.1對原材料的粗分級分離3
4.2對粗分離成分進行細分級分離3
4.3 蛋白的結晶與重結晶3
4.4 對分離出的蛋白質進行純度鑑定3
4.5 牛血清白蛋白質分離提純的整個工藝流程3
5.操作過程4
5.1蛋白質分離的準備階段4
5.2細分級分離裝置的設計4
5.3蛋白質的純度鑑定8
6.參考文獻8
7.課程設計心得9
1.設計任務書
現有一混合物料液中含有酪蛋白（分子量：57000da，pi 4.5）、β-乳球蛋白（分子量：
35000da，pi 5.1）、α-乳白蛋白（分子量：14000da，pi 4.
2）和牛血清白蛋白（分子量：66200da，pi 4.7），設計乙個分離純化工藝純化其中的牛血清白蛋白。
2.設計背景
2.1 牛血清白蛋白分離提純的簡介
蛋白質是（protein）是生命的物質基礎，沒有蛋白質就沒有生命。因此，它是與生命及與各種形式的生命活動緊密聯絡在一起的物質。機體中的每乙個細胞和所有重要組成部分都有蛋白質參與。
蛋白質佔人體重量的16%~20%，即乙個60kg重的成年人其體內約有蛋白質9.6~12kg。人體內蛋白質的種類很多，性質、功能各異，但都是由20多種氨基酸按不同比例組合而成的，並在體內不斷進行代謝與更新。
蛋白質具有很多生物化學共性，運用相關性質進行蛋白質的分離製備多種不同的單一蛋白質，更好的為人們所有。蛋白質的分離提純技術已經很成熟，相關的工藝流程包含各種不同的分離提純裝置，這些裝置運用蛋白質的不同原理對其進行分離純化，單一蛋白質的分離提純在現實生活中具有重要意義！
2.2 牛血清白蛋白分離提純的意義
牛血清中的簡單蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kd。等電點4.8。
含氮量16%，含糖量0.08%。僅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.
2%。白蛋白由581個氨基酸殘基組成，其中35個半胱氨酸組成17個二硫鍵，在肽鏈的第34位有一自由巰基。白蛋白可與多種陽離子、陰離子和其他小分子物質結合。
血液中的白蛋白主要起維持滲透壓作用、ph緩衝作用、載體作用和營養作用。在動物細胞無血清培養中，新增白蛋白可起到生理和機械保護作用和載體作用。牛血清白蛋白（bsa），又稱第五組分，是牛血清中的一種球蛋白，包含583個氨基酸殘基，分子量為66200da，等電點為4.
7。牛血清白蛋白在生化實驗中有廣泛的應用，例如在western blot中作為blocking agent。
3.設計原理
採用等電點沉澱、凝膠過濾、親和層析等方法對蛋白質進行分離提純，對相關分離提純所需條件可通過與電腦相連的方式進行精確控制，並在此基礎設計相關儀器分離提純蛋白質，在分離提純過程中運用到的蛋白質一些性質：分子大小、溶解度、等電點、吸附特性等。
根據生物分離原則：先純化，再脫鹽，最後成品加工。初步純化採用鹽析沉澱法，高度純化採用二維電泳。
鹽析沉澱原理：蛋白質在水溶液中的溶解度是由蛋白質周圍親水基團與水形成水化膜的程度，以及蛋白質分子帶有電荷的情況決定的。當用中性鹽加入蛋白質溶液，中性鹽對水分子的親和力大於蛋白質，於是蛋白質分子周圍的水化膜層減弱乃至消失。
同時，中性鹽加入蛋白質溶液後，由於離子強度發生改變，蛋白質表面電荷大量被中和，更加導致蛋白溶解度降低，使蛋白質分子之間聚集而沉澱。
4.設計工藝流程及設計方案說明
4.1對原材料的粗分級分離
當蛋白質提取液獲得後，選用一套適當的方法，將所要的蛋白質與其他雜蛋白分離開來。一般該步分離用鹽析、等電點沉澱和有機溶劑分級分離等方法。
4.2對粗分離成分進行細分級分離
這一步也就是樣品的進一步純化。樣品經粗分級分離以後，一般體積較小，雜蛋白大部分已被除去。進一步純化，一般使用層析法，還可以選用電泳、等電聚焦作為最後的純化步驟。
等電聚焦電泳就是使電泳的介質中形成一定範圍的ph梯度，電泳時待分離的兩性分子可以在這種ph梯度中遷移，直到聚集於與其等電點相同的區域。該技術特別適用於分子量相近而等電點不同的蛋白質分離和分析。
我們在設計完成自己創新的蛋白質電荷分離儀時就是依據等電聚焦的相關原理完成的，因此等電聚焦電泳分離蛋白質就是我們設計分離蛋白質的基本依據。
4.3 蛋白的結晶與重結晶
結晶是蛋白質分離純化的最後步驟，結晶過程本身也伴隨著一定程度的純化，而重結晶又可除去少量夾雜的蛋白質。結晶並不能保證蛋白質一定是均一的，但只有某些蛋白質在溶液中數量上佔優勢時才能形成結晶。
4.4 對分離出的蛋白質進行純度鑑定
蛋白質純度鑑定通常採用物理化學的方法，如電泳、沉澱、hplc和溶解度分析等。純的蛋白質和還有雜質的蛋白質在電泳等測量時會表現出不同的動向故而能夠進行純度的鑑定。
4.5 牛血清白蛋白質分離提純的整個工藝流程
工藝流程：動植物組織或細胞，細菌細胞裂解破碎→得到蛋白質提取液→通過鹽析、等電點沉澱等方法除去其中的雜質→的到體積較小，雜蛋白較少的蛋白提取液→經過層析、電泳、等電聚焦等方法進一步分離純化蛋白→結晶→重結晶→純度的鑑定→純度過低時重複以上幾步操作→得到單一牛血清白蛋白
5.操作過程
5.1蛋白質分離的準備階段
方法:鹽析
其原理由於大量中性鹽的加入使水的活度降低，原來溶液中的大部分甚至全部的自由水變成了鹽離子的水化水，那些被迫與蛋白質表面的疏水基團接觸並掩蓋它們的水分子成為下一步最自由地可以利用的水分子，因此留下暴露出來疏水基團的蛋白質，隨硫酸銨的進一步加入，蛋白質疏水基團進一步暴露，由於疏水作用蛋白質聚集沉澱。
在上步溶有蛋白質的緩衝液內加入中性鹽硫酸銨，隨著硫酸銨的加入，當離子濃度足夠高時，緩衝液中的蛋白質會沉澱下來，這樣就得到了蛋白質的粗提物，這步主要利用了鹽析原理。
通過以上兩個步驟完成蛋白質的初級分離，為下一步細分級分離做好準備。
5.2細分級分離裝置的設計
基於蛋白質分離的準備階段，對所要的目的蛋白進行分離
創新設計儀器名稱：蛋白質電荷分離儀
所設計儀器原理：蛋白質在非等電點溶液中帶電，在外加電場作用下會向相反電極移動；蛋白質在等電點時溶解度最低且不帶電荷，在外加電場下不會移動。精確控制分離緩衝液的ph，利用電泳作用分離帶點蛋白質和不帶電蛋白質。
主要過程包括以下兩方面要點：a、精確地控制反應容器內液體的ph，b、自由電泳分離帶電蛋白質。
所用器材：滴定管、鐵架臺、夾子、帶孔玻璃板、下部帶有出口圓形玻璃器皿、磁力攪拌器、ph計、電腦、電極、電源、透析紙袋等。
蛋白質電荷分離儀的主要構成：固定裝置、反應裝置、攪拌裝置、控制裝置、電泳裝置。
儀器介紹：
a.固定裝置
主要組成：鐵架臺、夾子、玻璃板等
主要用途：用於固定滴定管，方便調節ph的液體（酸、鹼、水）的滴加，再者固定與電極相連的電線，使裝置處於相對比較穩定的狀態。此裝置位於分離儀器的最上部。
b.反應裝置
主要組成：下部帶有出口圓形玻璃器皿、透析紙袋等
主要用途：用於盛裝反應液，ph計測定反應液的ph，電泳過程等主要反應過程都在這裡面進行。此裝置位於分離儀器的中部。
c.攪拌裝置
名稱：磁力攪拌器
原理: 利用磁性物質同性相斥的特性，通過不斷變換基座的兩端的極性來推動磁性攪拌仔轉動。適用於粘稠度不是很大的液體，或者固液混合物利用了磁場和漩渦的原理，將液體放入容器中後；將攪拌子同時放入液體；當底座產生磁場後帶動攪拌子成圓周迴圈運動，從而達到攪拌液體的目的。
用途：當滴定管液體滴入反應容器時會造成反應液各處ph不均勻，磁力攪拌器將液體攪勻，便於下面ph計的準確測定。
d.電泳裝置
組成：電極、電源、電線等
分類：自由電泳、區帶電泳
原理：生物大分子如蛋白質，核酸，多醣等大多都有陽離子和陰離子基團，稱為兩性離子。常以顆粒分散在溶液中，它們的靜電荷取決於介質的h+濃度或與其他大分子的相互作用.
在電場中，帶電顆粒向陰極或陽極遷移，遷移的方向取決於它們帶電的符號，這種遷移現象即所謂電泳。如果把生物大分子的膠體溶液放在乙個沒有干擾的電場中，使顆粒具有恆定遷移速率的驅動力來自於顆粒上的有效電荷q和電位梯度e。
用途：達到特定蛋白質等電點時，蛋白質溶解度最低且不帶電荷，在外加電場作用下不會向兩極移動；其它蛋白質在特定蛋白質的等電點時不是它們自己的等電點，因此帶點，在外加電場下會移動。用ph計精確控制分離緩衝液的ph，達到特定蛋白質的等電點，讓後自由電泳，將特定蛋白質與其它蛋白質分離開來。
e.控制裝置
名稱：ph計
組成：乙個參比電極；乙個玻璃電極，其電位取決於周圍溶液的ph；乙個電流計，該電流計能在電阻極大的電路中測量出微小的電位差。
牛血清蛋白標準曲線
牛血清蛋白表酚法定製牛血清蛋白及測定人體血清蛋白加樣操作表 樣1樣2試管編號200ug ml牛血清蛋白標準液 ml 0.000.300.400.500.600.700.800.90 1.001.00 1mol 1000ml人血清蛋白 ml ph7.4磷酸緩衝液 ml 1.000.700.600.50...